秋水仙碱对二氧化硅致大鼠肺成纤维细胞激活效应的抑制作用*

郝长付，张光辉，姚 武

郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室郑州450001

(2010-11-01收稿 责任编辑 徐春燕)

矽肺为尘肺中最常见的一种，主要是由于长期吸入含游离二氧化硅的粉尘，从而引起肺间质纤维化及矽肺结节。矽肺的发生是一个十分复杂的过程，其具体发病机制尚不清楚。研究［1］表明，二氧化硅刺激矽肺患者的肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)，通过介导肺成纤维细胞(lung fibroblast，LF)活化与增殖，促进胶原合成，参与矽肺纤维化的发生发展，其中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是LF激活的生物标识。作者观察了秋水仙碱对二氧化硅刺激AM引起的大鼠LF分泌α-SMA及胶原蛋白的影响，为矽肺的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 成年SPF级SD雄性大鼠由河南省实验动物中心提供，结晶型二氧化硅粉尘标准品由中国疾病预防控制中心劳动卫生研究所研制(游离二氧化硅含量为99.8%，粒径小于5μm的占95%以上)，秋水仙碱购自美国Sigma公司(纯度在95%以上)，优级胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司，DMEM培养基购自Gibco公司，第一链cDNA合成试剂盒购自天根生化科技有限公司，大鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原(COLⅠ、COLⅢ)酶联免疫试剂盒购自上海前尘生物有限公司，SYBR GreenⅠ购自厦门百维信生物科技有限公司。

1.2 游离二氧化硅粉尘工作液的配制 二氧化硅粉尘经研磨、干燥、干热灭菌(180℃，2 h)后，用无血清的DMEM培养基配成二氧化硅粉尘混悬液(100 mg/L)，4℃冰箱保存备用。

1.3 LF与肺AM的提取、纯化 参照严玉兰等［2］的方法提取和纯化大鼠LF，应用第5～10代细胞进行实验。参照丁焕然等［3］的方法提取和纯化大鼠肺AM。

1.4 实验分组 用无血清的二氧化硅培养基培养AM 24 h，离心收集培养液上清，加入秋水仙碱，使其终浓度分别为20、40和80μmol/L。大鼠LF分为秋水仙碱组、阳性对照组和阴性对照组，分别给予上述低、中、高浓度的秋水仙碱，含二氧化硅的AM培养液上清和不含二氧化硅的AM培养液上清，培养24 h。每组设3个平行样。

1.5 各组LF α-SMA、COLⅠ及COLⅢ mRNA水平的测定 采用Trizol法提取各组LF的总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，采用Real time-PCR法扩增目的基因COLⅠ、COLⅢ、α-SMA。反应体系:H2O211.7 μL，Taq PCR Mix 15 μL，上、下游引物各 0.8 μL，SYBR GreenⅠ 0.7 μL，cDNA 1.0 μL，共30 μL。α-SMA、COLⅠ和 COLⅢ反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸45 min，40个循环;72℃终延伸5 min。GAPDH反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，40个循环;72℃终延伸5 min。GAPDH、α-SMA、COLⅠ和COLⅢ引物序列及扩增产物大小见表1。以阴性对照组靶基因的表达水平为参照，各秋水仙碱组及阳性对照组与其的比值为该组靶基因的相对表达水平。

表1 扩增基因引物序列及扩增产物大小

1.6 各组LF培养液上清中COLⅠ、COLⅢ和总蛋白含量的测定 取各组LF的培养液上清，采用双抗体夹心ABC-酶联免疫吸附法测定COLⅠ、COLⅢ的含量，采用BradFord法测定样品的蛋白质浓度，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学处理 采用SAS 9.1进行分析。对5组间α-SMA、COLⅠ、COLⅢ mRNA的表达水平及COLⅠ、COLⅢ和总蛋白含量行方差分析和Dunnett检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 各组LF α-SMA、COLⅠ和 COLⅢmRNA的表达水平 见表2。

表2 各组LFα-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的表达水平

2.2 各组LF培养液上清中COLⅠ、COLⅢ和总蛋白含量比较 结果见表3。

表3 各组LF培养液上清中COLⅠ、COLⅢ和总蛋白的含量

3 讨论

矽肺的主要特征之一是LF的扩增和胶原的大量分泌。胶原在肺部大量沉积形成矽结节，在肺纤维化形成中起重要作用。Olbruck等［4］研究表明二氧化硅刺激AM分泌的大量的细胞因子促使LF活化，分泌大量细胞外基质包括胶原蛋白，并促进其细胞的增殖，而COLⅢ、COLⅠ和α-SMA等表达上调是LF活化的重要表现。国内研究［1］也表明，矽肺患者AM培养上清在促进LF增殖的同时，促进胶原合成与分泌，在肺纤维化进程中，细胞外基质主要由成纤维细胞产生。因此通过抑制LF增生或改变其生物学功能将有利于改善和减缓纤维化的发生发展。

秋水仙碱应用于纤维化的治疗已经有很久的历史，已知它能抑制纤维化进展［5-6］。该研究结果示不同浓度秋水仙碱干预后，LF中COLⅠ、COLⅢ和α-SMA的mRNA转录水平下降，表明秋水仙碱抑制了LF的激活效应，另外不同浓度的秋水仙碱干预后LF分泌的胶原蛋白和总蛋白均明显减少，说明秋水仙碱能够直接抑制LF分泌胶原蛋白从而达到减缓肺纤维化的进程，这与以往的有关报道［7-8］一致。

综上所述，秋水仙碱能抑制二氧化硅粉尘引起的LF的激活，减少其胶原蛋白的合成和分泌，最终达到抗纤维化的目的，从而为临床上使用秋水仙碱防治矽肺进展提供了理论依据。

［1］郝小惠，张丽，王献华.二氧化硅刺激矽肺患者肺泡巨噬细胞介导的人胚肺成纤维细胞增殖及对胶原合成分泌的影响［J］.中国煤炭工业医学杂志，2007，10(3):295

［2］严玉兰，刘洋，步雪峰，等.鼠肺细胞的分离纯化及原代培养［J］.江苏大学学报:医学版，2008，18(1):11

［3］丁焕然，马小兵，戴丽琴.二氧化硅对大鼠肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞TGF-β1表达的影响［J］.工业卫生与职业病，2007，33(4):214

［4］ Olbruck H，Seemayer NH，Voss B，et al.Supernatants from quartz dust treated human macrophages stimulate cell proliferation of different human lung cells as well as collagen-synthesis of human diploid lung fibroblasts in vitro［J］.Toxicol Lett，1998，96/97:85

［5］Antoniou KM，Nicholson AG，Dimadi M，et al.Long-term clinical effects of interferon gamma-1b and colchicine in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Eur Respir J，2006，28(3):496

［6］ Fiorucci E，Lucantoni G，Paone G，et al.Colchicine，cyclophosphamide and prednisone in the treatment of mildmoderate idiopathic pulmonary fibrosis:comparison of three currently available therapeutic regimens［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2008，12(2):105

［7］黄文彦，孙骅，潘晓勤，等.秋水仙碱对成纤维细胞产生细胞因子以及分泌细胞外基质的影响［J］.中华儿科杂志，2004，42(7):524

［8］吴江锋，张艳琼，柳长柏，等.抗肝纤冲剂对肝纤维化小鼠Ⅰ型胶原蛋白表达的影响［J］.吉林大学学报:医学版，2010，36(4):651