复合芽孢杆菌在海水养殖水体中脱氮的研究

石玉新，齐树亭，吕玉珊，杜运福

（河北工业大学 海水资源高效利用化工技术教育部工程研究中心，天津 300130）

高密度海水养殖造成大量饵料和粪便的积累，粪便和饵料在微生物的作用下会产生氨氮，致使养殖池塘中氨氮浓度增加[1]．养殖水体中氨氮浓度增加，对养殖主体会造成危害，而且氨氮在硝化细菌等微生物的作用下会转变成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，尤其是亚硝酸盐氮会威胁养殖主体的生命，而且还会造成水体的富营养化，使养殖池塘环境进一步恶化[2-3]．国家规定，氨氮超标的养殖废水，不得排放入大海和河流．所以，去除海水养殖废水中氨氮一直以来是养殖业最为关注的问题之一．利用微生物制剂来降低水体中的氨氮，不会引起二次污染，而且方法简单，成为海水养殖废水脱氮研究的热点[4]．

生物脱氮过程分为硝化作用和反硝化作用，一般认为硝化细菌为自养型细菌，但近年来发现，一些异养细菌也能进行硝化作用，如：如脱氮副球菌 (Paracoccusdenitrificans)，粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，芽孢杆菌(Bacillussp.)，节杆菌(Arthrobacter sp.)和红球菌(Rhodococcus sp.)[5-10]等，异养硝化细菌能够在利用有机碳源生长的同时将含氮化合物硝化生成羟胺、亚硝酸盐、硝酸盐等产物，多数还能同时进行好氧反硝化作用,直接将硝化产物转化为含氮气体．虽然异养硝化细菌的硝化速率比自养硝化细菌慢，但是异养硝化细菌生长速率快，而且适应性比自养菌要好[11]，所以，将异养硝化细菌用于海水脱氮的研究具有广阔的前景．

国内外大量研究表明，芽孢杆菌对氨氮、亚硝酸盐及硝酸盐有很好的去除效果，能改良水质，抑制病原菌等[12-14]，目前市场上已有多种芽孢杆菌水质调节剂，但欠缺有效性和针对性，缺乏优良的芽孢杆菌菌株．

本实验室从养殖池塘底泥中筛选出两株能去除氨氮的芽孢杆菌，并对这两株芽孢杆菌在海水脱氮条件进行了研究，同时将两株菌进行复配，研究了复合菌株对氨氮的去除，并通过正交实验研究分析温度、转速和pH对菌株脱氮能力的影响，以期寻找最佳的脱氮条件．

1 材料与方法

1.1 菌株

从秦皇岛昌黎县江鹏水产养殖公司的排污池底泥中分离．

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，加海水至1 L，pH 7.0～7.2．

刺激芽孢杆菌生长培养基：蛋白胨10 g，酵母膏3 g，淀粉3 g，MgSO40.1 g，K2HPO42 g，加海水至1 L，pH=7.8．

芽孢杆菌分离培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，酵母膏5 g，K2HPO44 g，MnSO40.0154 g，加水至1 L，琼脂3%．

异养亚硝化培养基：NH42SO40.382 g，葡萄糖5g，K2HPO40.2 g，加水至1 L，pH=7.0～7.2．

异养硝化培养基：葡萄糖5 g，亚硝酸钠0.2 g，K2HPO40.1g，加海水至1 L，pH=7.0～7.2．

反硝化培养基：葡萄糖5 g，硝酸钾0.2 g，K2HPO40.1 g，加海水至1 L，pH=7.0～7.2．固体培养基加3%琼脂．

人工废水： NH42SO40.367 g，亚硝酸钠0.2 g，葡萄糖1 g，柠檬酸钠0.1 g，K2HPO40.017 5g，加海水至1 L，pH=7.0～7.2．

以上培养基均在121℃下灭菌25 min．

1.3 分析方法

氨氮的含量按照GB/T12763.4-2007测定，亚硝酸盐的含量按照GB/T12763.4-2007重氮偶氮法测定，硝酸盐的含量按照GB/T12763.4-2007锌镉还原法测定．OD值用722分光光度计在最大吸收波长下测定吸光度．

1.4 芽孢杆菌的筛选及鉴定

取4 g底泥，加入到装有100 mL的三角瓶中，120 r/min，30℃摇床中培养12 h，然后在60℃水浴锅中加热25 min，采用梯度稀释法将菌液稀释101,102,103,104,1055个梯度，取104、105两个梯度的稀释液100L于刺激芽孢固体培养基上涂布后，在30℃培养箱中倒置培养，待长出单菌落后，选取菌落形态不同的单菌落，采用划线法转接到芽孢杆菌分离培养基上，待长出单菌落后，再次划线转接，转接3次，得到较纯的菌株．将筛选得到的单菌株转接到异养亚硝化、异养硝化和反硝化固体培养基中，30℃培养箱中倒置培养．初步筛选出能利用氨氮、亚硝态氮及硝态氮的菌株．并将得到的菌株接种到没有加入有机碳源的亚硝化及硝化固体培养基中，考察得到的菌株是否具有自养亚硝化及硝化性能．

将筛选出的菌株进行革兰氏染色和芽孢染色在显微镜下观察其形态，并根据《伯杰式细菌鉴定手册》做生理生化鉴定．

1.5 芽孢杆菌脱氮性能的研究

1.5.1 芽孢杆菌最大吸收波长的测定

将筛选得到的芽孢杆菌接种到盛有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，在30℃，摇床中150 r/min震荡培养12 h后，以未接种的培养基做空白对照，在400～700 nm的波长下测定OD值，找出芽孢杆菌最大吸收波长．

1.5.2 芽孢杆菌生长曲线的绘制及去除氨氮和无机氮能力的研究

将能在异养亚硝化固体培养基中生长的芽孢杆菌接种到装有100 mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，30℃，150 r/min，摇床中培养24 h后，离心取菌体，将得到的菌体悬浮于灭菌的海水中制成菌悬液．按5%（体积分数）的比例接种于装有100mL异养亚硝化液体培养基的250mL三角瓶中，并做空白对照，30℃，150 r/min摇床中培养．每隔3 h测定OD值，绘制菌株在异养亚硝化液体培养基中的生长曲线．每隔6 h取样，离心取上清液测定氨氮及亚硝酸盐氮的含量，并绘制无机氮的去除曲线，考察两株菌对无机氮的去除效果．无机氮浓度计算公式为

1.5.3 菌株对亚硝酸盐氮及硝酸盐氮的去除能力的研究

将能在异养硝化及反硝化固体培养基中生长的芽孢杆菌接种到装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，方法同上，每隔6 h取样，离心取上清液测定亚硝酸盐氮或硝酸盐氮的含量．

1.6 芽孢杆菌复合比的确定

将筛选出的两株芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基中进行扩大培养，然后离心，弃上清液将菌体转移到灭菌的海水中制成菌悬液，在显微镜下，调整菌悬液浓度为108个/mL，按照两株菌的比例W01∶Y01（每毫升所含细胞个数比）为1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1配成复合菌悬液，按照5%（体积分数）的接种量接入人工废水中，分别以接入单菌株的菌悬液作为对照，以未接菌的人工废水作为空白对照，30℃，150r/min摇床中培养，30h后测定氨氮废水中的氨氮、亚硝酸盐氮及硝酸盐氮的含量．无机氮浓度计算公式如式 (1)，计算去除率，并与单一菌株做对比，确定最佳复合比例．

1.7 复合菌株去除氨氮的环境因素影响

2 结果与讨论

2.1 芽孢杆菌的筛选与鉴定

在刺激芽孢生长培养基上长出两种菌落形态不同的菌株，一种为白色菌落，菌落大且边缘平整，不透明．一种为深黄色，边缘整齐．采用平板划线分离得到两株形态不同的菌株．

革兰氏染色显示两株菌均为革兰氏阳性细菌，对两株菌进行芽孢染色，在显微镜下观察，发现两株菌中均有被染成绿色的芽孢，芽孢中生，两株菌都是杆状．将白色菌株命名为W01，将黄色菌株命名为Y01．

对分离得到的两株菌进行生理生化鉴定，得到的结果如表2所示．

由菌株的镜检结果及生理生化特征，根据《细菌鉴定常用手册》及《伯杰式细菌鉴定手册》，初步判断两株菌株为芽孢杆菌属．

将两株菌株划线接种到异养亚硝化培养基、异养硝化培养基及异养反硝化培养基中，发现只有两种菌在异养亚硝化培养基上都能生长，说明两株菌均能利用氨氮．但是黄色菌株 Y01不能在异养硝化培养基和异养反硝化培养基上生长．初步断定，W01菌株可以利用氨氮、亚硝酸盐氮及硝酸盐氮，而Y01菌株只能利用氨氮，不能利用亚硝酸盐氮和硝酸盐氮．

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Orthogonal factor level table

表2 W01及Y01菌株生理生化特征Tab.2 W01 and Y01 physiological and biochemical characteristicsof strains

将W01及Y01菌株接种到没有加入有机碳源的亚硝化及硝化固体培养基上，发现两株菌均不能生长，由此判断这两株菌不是自养细菌，没有自养亚硝化及硝化性能．

2.2 W01与Y01菌株脱氮性能的研究

2.2.1 芽孢杆菌最大吸收波长的测定

W01及Y01两株芽孢杆菌对不同波长的吸收结果如图1所示．在600 nm处W01及Y01两株芽孢杆菌均有最大吸收．所以选择在600 nm波长测定菌体OD值．

2.2.2 W01与Y01菌株在异养亚硝化液体培养基中的生长曲线的绘制

W01与Y01菌株在异养亚硝化液体培养基中的生长曲线如图2所示．由图2可以看出，W01和Y02菌株在异养亚硝化培养基中的延滞期很短，在3h后即进入对数期，说明这两株菌对环境的适应能力很强，3～21h之间是菌体生长的对数期，这时候培养基中的菌体密度显著增大，大约24h后菌体密度达到最大值，进入稳定期，并且Y01的菌体浓度大于W01菌株．

2.2.3 W01与Y01菌株去除氨氮及无机氮能力的研究

在接种W01和Y01菌株的培养基中，氨氮及亚硝酸盐氮含量变化如图3所示．由图3中可以看出，随着菌株生长，培养基中氨氮的含量逐渐降低，6～30h之间氨氮浓度急剧减少，对比菌株的生长曲线发现，在稳定期时，氨氮浓度减少到最小．这种现象表明，氨氮的去除与菌体生长相关联．培养基初始氨氮浓度为大约100 mg/L，36 h后接入W01菌株的培养基中氨氮的去除率为78%左右，而接入Y01菌株的培养基中氨氮的去除率在83%左右．Y01菌株对氨氮的去除效果优于W01菌株．

图1 W01及Y01的最大吸收波长Fig.1 Themaximum absorption wavelength of W01 and Y01

图2 W01与Y01菌株在异养亚硝化液体培养基中的生长曲线Fig.2 Thegrowth curveof W01 and Y01 strainsin heterotrophic nitrification liquid culturemedium

图3 W01及Y01的氨氮去除曲线及亚硝酸盐氮积累曲线Fig.3 Thedegradation curveof ammonia and theaccumulation curveof nitrite nitrogen of W01 and Y01

由图3中可以看出，W01菌株与Y01菌株在生长过程中均对亚硝酸盐氮有一定的积累，W01菌株在18h时，亚硝酸盐氮积累量达到最大值，为5.76mg/L，24h后，亚硝酸盐氮的含量逐渐降低．48h时亚硝酸盐的含量为0.87mg/L，说明W01菌株对亚硝酸盐氮的积累主要是在菌体的对数生长期．而Y01菌株对亚硝酸盐氮的积累量是逐渐增加的．48 h时亚硝酸盐氮的含量达到最大值为22.14 mg/L．Y01菌株对亚硝酸盐氮的积累率明显高于W01菌株．

培养基中无机氮含量的变化如图4所示．培养基中无机氮含量随着菌体密度的增加而减少，在对数生长期无机氮的减少速率很快，在36h时两株菌对无机氮去除量达到最低，此时，W01对无机氮的去除率为76.96%，Y01对无机氮的去除率为76.14%．由此可以看出，W01与Y01对无机氮的去除效果相差不多．

2.2.4 W01菌株对亚硝酸盐氮及硝酸盐氮的去除能力的研究

图4 W01与Y01无机氮去除曲线Fig.4 Degradation curveof inorganic nitrogen of W01 and Y01

图5 W01菌株培养基中亚硝酸盐氮及硝酸盐氮含量随时间的变化曲线Fig.5 W01strainof mediumnitritenitrogenand nitrate nitrogen content changes curvewith time

由图5可以看出，24 h之内亚硝酸盐氮及硝酸盐氮含量减少的速度最快．36 h时浓度均降低到最低．培养基中亚硝酸盐氮的起始含量为2.9mmol/L左右，W01菌株在接入培养基24h后，能使亚硝酸盐氮的含量维持在0.5mmol/L左右，在36h后亚硝酸盐氮的含量达到最低，为0.35 mmol/L．W01菌株对亚硝酸盐氮去除率大约为82%．

培养基中硝酸盐氮的起始含量在2.35mmol/L左右，接入W01菌株24 h后硝酸盐氮的含量维持在0.7 mmol/L左右，36 h后培养基中硝酸盐氮浓度达到最低，为0.57 mmol/L．W01对硝酸盐的去除率大约为70%．

以上结果表明，W01菌株在36h内对亚硝酸盐氮及硝酸盐氮都具有良好的去除效果．

2.3 复合芽孢杆菌去除海水养殖废水中的氨氮

2.3.1 芽孢杆菌复合比的确定

由表3中可以看出，Y01菌株对氨氮的去除率最高，为79.76%，而无机氮的去除率却只有49.32%，W01菌株对氨氮的去除率为69.37%，低于Y01菌株，但对无机氮的去除率为67.19%，比Y01菌株的去除率要高．复合菌株W01∶Y01=1∶3时对氨氮的去除率最高，为78.21%，与Y01菌株对氨氮的去除率相差不大，而对无机氮的去除率能达到71.22%．说明当将W01与Y01菌株以最优复合比（每毫升所含菌体个数之比）为W01∶Y01=1∶3接入人工废水中时，两株菌对废水中氨氮及无机氮都能起到很好的去除效果．

众多研究表明，不同的菌株对不同形式的氮的去除效果各不相同[15-17]，有一定的局限性．将功能不同且不会产生拮抗作用的菌株进行复合，得到复合菌株，可以对水体中各种形式的无机氮都能达到良好的去除效果．

表3 接入复合芽孢杆菌36 h后人工废水中各种氮的含量Tab.3 The content of thevarious nitrogen after 36 h when complex Bacillus accessed the artificial water

2.3.2 复合菌株去除氨氮的环境因素的影响

正交实验结果分析如表4所示．对正交实验结果进行分析发现，36h后的无机氮去除率均高于40%，计算不同因素各个水平下的去除率以及反映各因素对指标影响大小的极差R，R越大，说明因素对指标的影响越大．由表4中可以看出，各因素影响的顺序为pH>转速>温度．由正交试验结果分析得出复合芽孢杆菌在条件为pH=6.5，温度为35℃，转速为200 r/min，无机氮的去除率达到最高为82.38%．

由以上实验结果分析可知，芽孢杆菌比硝化细菌对环境的适应能力强，pH在6.5～8.5，温度在15～35℃之间时芽孢杆菌都能很好的生长并对无机氮有很好的去除效果．在温度及pH较低时，硝化细菌的生长和繁殖受到抑制，硝化作用明显减弱．而芽孢杆菌对温度和pH耐受性较强，在水产养殖池塘中对氨氮及亚硝酸盐氮的去除能达到理想的效果．且硝化细菌为自养型细菌，生长缓慢，不能在较短的时间内使养殖池塘中的氨氮迅速去除．而芽孢杆菌是异养型细菌，繁殖迅速，可以短时间内降低水体中氨氮及亚硝酸盐氮的含量．

3 结论

1）从海水养殖池塘底泥中筛选出两株菌落形态不同的芽孢杆菌 W01与 Y01，经研究发现，W01菌株对氨氮、亚硝酸盐氮及硝酸盐氮都有很好的去除效果．而Y01对氨氮有很好的去除效果，但在去除氨氮的同时，对亚硝酸盐氮有大量积累，且在以亚硝酸盐氮或硝酸盐氮为唯一氮源的培养基上不能生长．

2）由于W01与Y01两株菌对不同的无机氮去除效果不同，将两菌株进行复配，使其共同作用于含氮废水，研究结果表明，当W01∶Y01(细胞数目比)=1∶3时，对无机氮的去除率可以达到最大值．

表4 正交实验直观分析结果Tab.4 Visual analysis of orthogonal experiment

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