血管紧张素转移酶mRNA在胃癌中的表达

牛 辉 陈光裕 苑克伟 史美龙 陈治龙 (北华大学附属医院普外科，吉林 吉林 320)

胃癌的确切发病机制尚未完全阐明。血管紧张素转移酶(ACE)，又称激肽酶Ⅱ，是高血压和肾脏疾病研究的热点基因。近年来，发现其在肿瘤血管生成、细胞生长、迁移和转移中发挥重要的作用〔1〕。ACE抑制剂能够抑制肿瘤生长、血管生成和细胞基质降解〔2〕。ACE蛋白质和 mRNA在胃癌中明显高表达〔3〕，然而，ACE mRNA与胃癌临床病理特征的关系尚未见文献报道，本研究采用实时荧光定量PCR检测ACE mRNA在胃癌中的表达，并探讨其与胃癌的发生、发展和浸润转移的关系。

1 材料与方法

1.1 样本收集 胃癌及癌旁组织各34例，均来自我院手术切除标本，手术切除组织立即液氮冻存，肿瘤组织均经病理检查证实。其中男20例，女14例，平均年龄(58.4±12.1)岁。

1.2 仪器与试剂 ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。TRIpure Reagent购自北京百泰克公司，逆转录试剂盒和SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR试剂盒均购自Fermentas公司。

1.3 实时荧光定量PCR检测胃癌组织中ACE mRNA的表达用Trizol法提取胃癌组织及癌旁组织总RNA。以总RNA为模板，按照 Fermentas公司反转录试剂盒说明书操作，获得cDNA。参照文献〔4〕设计ACE引物:上游:5'-CTCAAGTACTTCCAGCCAGTC-3';下游:5'-GCAGAATCTTGCTGGTCTCTG-3'。内参GAPDH:上游:5'-GAAGGTGAAGGTCG GAGTC-3';下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，引物由上海英俊生物有限公司合成。按照100、101、102、103和104梯度稀释 cDNA，制作标准曲线，采用双标准曲线法定量分析。20 μl反应体系中加入cDNA 模版 2.0 μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 × )10.0 μl，上、下游引物(20 pmol/μl)各 0.3 μl，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，去离子水补足 20 μl。反应条件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。以GAPDH为内对照，并分别加阴性对照。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR扩增产物特异性验证 实时荧光定量PCR溶解曲线平滑、峰高而尖，表明无非特异性扩增条带和引物二聚体形成，引物的特异性较好，可用于实时荧光定量PCR。见图1。

图1 ACE基因实时荧光定量PCR溶解曲线

2.2 实时荧光定量PCR检测ACE mRNA表达 ACE mRNA在胃癌组织中表达(0.94±0.47)显著高于癌旁组织(0.65±0.42)(P=0.003)。胃癌组织ACE mRNA表达与分化程度(高中分化为 n=19，0.90±0.47;低分化为 n=15，0.99±0.48)、临床分期(Ⅰ ～ Ⅱ期 n=17，1.06±0.48;Ⅲ ～ Ⅳ期 n=17，0.82±0.43)和转移状态(有转移 n=18，0.96 ±0.42;无转移n=16，0.91±0.52)等临床病理特征无相关性(P＞0.05)。

3 讨论

ACE是肾素血管紧张素系统的关键酶，主要作用是催化无活性的血管紧张素Ⅰ转化为增加血管压力的血管紧张素Ⅱ，此外，也可使缓激肽等血管活性物质失活。由于其收缩血管和升高血压的作用，长期以来作为高血压和肾脏疾病研究的热点。近年来，发现ACE可以影响肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成和远处转移等生物学行为〔1〕。动物实验和临床研究均显示:使用ACE抑制剂具有抑制肿瘤生长、血管生成、细胞外基质降解和治疗恶病质的多种作用〔2〕。

研究证实:ACE在多种肿瘤中存在差异性表达。例如:Rocken等运用实时荧光定量PCR检测到ACE mRNA在结肠癌组织的表达显著高于其在对应的非病变组织表达〔4〕。国内外研究均报道:血清ACE活性在多种肿瘤，包括胃肠道肿瘤、乳腺癌、肺癌和头颈癌等明显低于正常对照组〔5～7〕，并且与转移和预后等生物学活性有关，即有转移的肺癌患者中ACE活性明显低于未转移者，治疗期间患者中ACE活性明显低于恢复期患者，ACE活性越低，预后越差。Carl-McGrath等分别运用免疫组化和实时荧光定量PCR技术观察到ACE蛋白质和mRNA在胃癌中明显高表达〔3〕。

本研究结果提示ACE在胃癌的发生发展中发挥较重要作用。虽然目前尚不清楚其准确分子机制，但本研究结果为今后进一步深入研究ACE基因表达在胃癌发病机制中的作用奠定了有利基础。

1 Deshayes F，Nahmias C.Angiotensin receptors:a new role in cancer〔J〕?Trends Endocrinol Metab，2005;16:293-9.

2 Lever AF，Hole DJ，Gillis CR，et al.Do inhibitors of angiotensin-Ⅰ-converting enzyme protect against risk of cancer〔J〕?Lancet，1998;352:179-84.

3 Carl-McGrath S，Lendeckel U，Ebert M，et al.The ectopeptidases CD10，CD13，CD26，and CD143 are upregulated in gastric cancer〔J〕.Int J Oncol，2004;25:1223-32.

4 Rocken C，Neumann K，Carl-McGrath S，et al.The gene polymorphism of the angiotensinⅠ-converting enzyme correlates with tumor size and patient survival in colorectal cancer patients〔J〕.Neoplasia，2007;9:716-22.

5 Varela A，Saez JBL.Utility of serum activity of angiotensin-converting enzyme as a tumor marker〔J〕.Oncology，1993;50:430-5.

6 刘 虹，裴 彰.血清及支气管肺泡灌洗液中CA-50，CEA，ACE检测对肺癌诊断的价值〔J〕.山西医科大学学报，1998;29(2):134.

7 张 伟.血管紧张素转化酶检测对肺癌诊断的临床意义〔J〕.天津医科大学学报，2002;8(3):355-6.