法尼醇X受体在高甘油三酯血症大鼠肾脏的表达和定位

胡志娟 刘 冰 任路平 李 凡 孙 文 宋光耀 (河北省人民医院肾内科，河北 石家庄 05005)

当今饮食结构的变化致使果糖的摄入量逐年增加。果糖代谢导致甘油三酯(TG)的甘油和酰基部分明显增多，导致脂质从头合成以及TG合成的速率明显增强〔1〕。脂质肾毒性学说认为，在一些情况下，循环中的脂质可能直接损害肾小球结构，高脂血症在启动肾小球损害至肾小球硬化的过程中是一个重要的加重因素〔1〕。法尼醇X受体(farnesoidreceptor，FXR)在肝脏、肾脏、肾上腺和小肠组织中高表达，同时还存在于脂肪组织、心脏、脾脏和血管平滑肌中〔2〕。FXR参与机体内胆汁酸的代谢、脂代谢和糖代谢，并起着重要的调节作用〔3〕。本研究采用高果糖饮食喂养诱导大鼠高TG血症，观察肾组织脂质的蓄积、肾脏病理形态的变化以及FXR的表达和定位，并通过胆汁酸治疗进一步探讨脂质肾毒性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 健康雄性Wistar大鼠32只(由河北医科大学动物室提供)，体重200 g左右，随机分成正常对照组(N组)及高果糖组(F组)，每组16只。正常对照组为普通饲料，高果糖组中果糖占热量的34.5%。每日记大鼠进食量，每周记大鼠体重。喂养8 w及16 w时各处死大鼠8只，大鼠处死前一天采用代谢笼收集24 h尿标本，处死时留取血标本。肾脏经生理盐水充分灌洗后称重，部分组织以10%甲醛固定、石蜡包埋，制成3 μm厚切片，其余组织液氮保存备用。

1.2 生化测定 大鼠处死时以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉各组大鼠(2 ml/100 g)，右侧颈动脉取血标本约8 ml。血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FPG)及血脂的测定在Beckman全自动生化分析仪上完成。24 h尿微量白蛋白(24 h UMA)定量采用免疫比浊法。

1.3 肾皮质脂质提取及TG测定 以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉各组大鼠(2 ml/100 g)，用0.1 mmol PBS缓冲液进行左肾灌洗，灌洗速度为10 ml/min，PBS总量为50 ml，灌洗后肾脏呈灰白色，分离肾皮质，取200 mg皮质按Macala〔4〕等方法进行脂质提取及定量分析。

1.4 肾组织病理检测 经10%甲醛固定的肾组织石蜡包埋，制成3 μm厚的切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化行PAS染色。肾组织5 μm冰冻切片行油红O脂质染色。

1.5 免疫组织化学法检测FXR的表达 10%甲醛固定、石蜡包埋的肾组织进行3 μm厚的连续切片。二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，热修复140℃、2 min;3%过氧化氢室温孵育10 min灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗2 min×3;滴加兔抗FXR抗体(美国，Santa Cruz)，4℃过夜，PBS 冲洗2 min×3;再依此加入聚合物辅助剂和辣根酶标记的兔抗IgG工作液，37℃孵育20 min，每个步骤后均PBS冲洗，2 min×3。DAB(二氨基联苯胺)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片镜检。PBS(磷酸盐)缓冲液替代一抗作阴性对照。

2 结果

2.1 左肾重/体重(KW/BW)、肾功能、血脂、FPG及24 h UMA比较 与对照组比较，8 w及16 w高果糖组大鼠KW/BW、BUN、Scr、胆固醇(TC)及FPG变化无明显差异(P＞0.05);TG、极低密度脂蛋白(VLDL)及24 h UMA在高果糖组明显升高(P＜0.05)，且随时间延长其水平均增加。见表1。

2.2 肾皮质TG含量 与对照组〔8 w:(4.30±0.76)mg/g，16 w:(5.16±1.70)mg/g〕比较，高果糖组肾皮质 TG含量〔8 w:(7.21±2.20)mg/g，16 w:(7.92±3.05)mg/g〕明显增加(P＜0.05)，且随时间延长其水平均增加。

表1 各组大鼠左肾重/体重、肾功能、血脂、FPG及24 h UMA比较(± s，n=8)

表1 各组大鼠左肾重/体重、肾功能、血脂、FPG及24 h UMA比较(± s，n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05

对照组 8 w 3.11±0.27 6.46±0.50 33.75±3.28 1.50±0.210.79±0.31 0.40±0.14 5.19±0.58 20.00±6.00 16 w 3.34±0.56 6.59±1.37 41.39±6.39 1.66±0.14 1.09±0.36 0.50±0.16 5.45±0.47 45.00±24.00高果糖组 8 w 3.38±0.22 6.54±0.66 42.56±8.25 1.59±0.20 1.65±0.861)0.75±0.391) 5.84±0.56 63.00±12.001)16 w 3.63±0.41 6.69±0.85 45.57±3.67 1.82±0.65 2.13±0.871)0.97±0.401) 6.01±0.37 150.00±48.001)

图1 各组大鼠肾组织PAS染色(×200)

图2 各组大鼠肾组织油红O染色(×200)

图3 各组大鼠肾组织中FXR免疫组织化学表达(×200)

2.3 肾脏病理改变 光镜下可见(PAS染色)高果糖组大鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾小管上皮空泡及颗粒变性，随时间延长，病变加重，肾间质及小血管未见明显病变。油红O染色可见高果糖组肾小球及近端肾小管内油红O染色阳性，随时间延长，病变加重，提示中性脂质进行性蓄积。见图1、图2。

2.4 肾组织FXR的表达 FXR在正常大鼠肾脏组织中主要分布在近曲小管，高果糖组大鼠FXR在上述区域的表达显著下调，随病程延长，表达减弱。见图3。

3 讨论

果糖同葡萄糖相比，更能诱导胆固醇反应元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和肝脏脂质从头合成〔1〕。果糖对机体的危害有:肥胖、加速衰老、胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病并发症(视网膜病变、肾脏疾病、神经疾病)、非酒精性脂肪肝、高甘油三酯血症、高尿酸血症、慢性腹泻、肠应激综合征、荨麻疹〔5〕。

肾脏疾病时常常伴有高TG血症，研究发现血清TG水平与尿蛋白排泄率、肾小球滤过率的下降有显著相关性〔6〕，提示TG以及富含TG的脂蛋白具有肾毒性作用。脂质在肾脏沉积，在炎症细胞浸润、肾脏固有细胞增生和损伤、细胞外基质积聚及泡沫细胞形成等过程中，直接或间接地导致肾小球硬化。

本研究中，经过8 w高果糖饮食诱导大鼠高TG血症及高VLDL血症而血糖水平无明显升高;16 w时，大鼠的上述指标升高更为明显而血糖水平仍无显著差异，提示脂代谢紊乱往往出现在糖代谢紊乱之前。本研究发现，高果糖饮食诱导大鼠在肾皮质亦出现TG的蓄积，表现在肾皮质TG含量增加以及油红O染色可见阳性的细胞，随时间延长，上述指标水平升高。高果糖组大鼠在实验8 w时出现尿微量白蛋白水平显著增加，该指标是早期肾损害较为敏感的指标，提示肾脏损伤。PAS染色可见高果糖组大鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾小管上皮空泡及颗粒变性，随时间延长，病变加重，肾间质及小血管未见明显病变。

FXR是1995年首先克隆和命名的，在肝脏、小肠、肾脏和肾上腺高表达，在脂肪和心脏中低表达，FXR蛋白有典型的核受体结构〔2〕。FXR的生物学主要进展是发现胆汁酸可以作为此核受体的内源性配体，生理浓度下的多种初级和次级胆汁酸以及一些多不饱和脂肪酸可激活FXR〔7〕。FXR参与胆汁酸代谢，参与调节糖代谢和脂代谢，与多种疾病密切相关。

在脂代谢过程中，FXR能调节磷脂转移蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)的表达，加速磷脂和胆固醇从富含TG的脂蛋白向高密度脂蛋白转运〔8〕;FXR还能上调肝细胞膜上的清道夫受体B(cavenger receptor B1，SR-B1)，从而增加高密度脂蛋白介导的胆固醇逆转运〔9〕。FXR能通过调控脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)、微粒体TG转移蛋白 (microsomal triglyceride transfer protein，MTP)，调节TG代谢。人体内，FXR可调控过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)活性，胆汁酸激活 FXR可通过 SHP下调SREBP-1c的表达最终使血浆中TG含量减少〔10〕。因此，激活FXR就能够降低TG，从而对肾脏起保护作用。

本研究免疫组织化学表明，FXR在正常大鼠肾脏组织中主要分布在近曲小管，高果糖组大鼠FXR在上述区域的表达显著下调，随病程延长，表达减弱。表明肾脏的固有细胞均参与了肾脏疾病的发生发展。

综上所述，高果糖饮食可导致大鼠高TG血症并使健康大鼠出现显著的肾脏病理损害。因此，选择健康的生活方式，积极控制高TG血症对防治或延缓肾脏疾病进行性恶化具有十分重要的现实意义。

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