沉默G250基因对肾癌786-0细胞体内成瘤及生长的影响

赵俊峰 郑少斌 姜耀东 赵善超 杨旭凯

(河南省中医院 河南中医学院第二附属医院泌尿外科，河南 郑州 450002)

肾癌是老年人常见的恶性肿瘤，其发生发展的分子生物学机制至今不清，多数研究显示G250(又称MN/CAⅨ)基因可诱导细胞恶性表型〔1〕，并参与了肾脏肿瘤细胞的生长与转移。因此通过基因重组技术抑制该基因的表达可能为肾脏肿瘤患者带来曙光。本研究在成功构建肾癌相关抗原G250siRNA表达载体的基础上〔2〕，利用RNA干扰(RNAi)技术阻断G250基因表达，观察了G250基因沉默对肾癌786-0细胞体内成瘤及生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肾透明细胞癌786-0细胞株(以下称肾癌786-0细胞)及大肠杆菌DH5α由南方医科大学南方医院泌尿外科保存。4～6周龄的12只BALB/c裸鼠为SPF级，体重15～20 g，雌雄各半，购自南方医科大学实验动物中心，在南方医院SPF实验动物中心饲养。OPTI-MEMⅠ培养基及RPMI 1640培养基、胎牛血清(GIBCO公司)，lipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，G418及 DEPC(Sigma公司)，空质粒 pRNATU6.1/Neo(GenScript公司)，限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4 DNA连接酶、T4磷酸化酶、质粒提取试剂盒、PBS(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA靶序列的设计和质粒的构建 G250 mRNA的全长序列从NCBI基因库(Genebank登录号:AJ010588)检索得出。应用Primer express软件按照siRNA的设计原则寻找含21个碱基的特异性序列。在前期实验的基础上，选择最有效的G250的siRNA片段，靶位点293～313，根据pRNAT-U6.1/Neo质粒的结构，设计出特异性干扰片段的核苷酸序列:5'-GGATCCCATTTAGGCTTAACTTCAGGTATTGA TATCCGTACCTGAAGTTAAGCCTAAATTTTTTTCCAAAAGCTT-3'，5'-AAGCTTTTGGAA AAAAATTTAGGCTTAACTTCAGGTACGGATATCAATACCTGAAG TTAAGCCTAAATGGGATCC-3'。序列送由南京金思特公司合成。将退火后shRNA寡核酸双链和pRNAT-U6.1/Neo酶切产物按3∶1混合，T4DNA连接酶27℃连接过夜，转化感受态DH5α大肠杆菌。然后提取待测的重组质粒。酶切鉴定正确后取1 ml转化菌液，送金思特公司测序。

1.2.2 siRNA转染及建立稳定干扰G250基因抗性单克隆肾癌786-0细胞培养时，培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640。转染前24 h，传代至24孔板，每孔 l.5×105个细胞。用LipofectamineTM2000进行转染。转染后6 h换成完全培养基，继续培养72 h，加入选择性培养基进行筛选，根据G418对肾癌786-0细胞在14 d内的杀灭效果，我们选择600 μg/ml作为筛选浓度。筛选培养2 w后可见抗性克隆长出，挑取单克隆转入24孔板逐渐扩大培养，4 w左右可获得稳定干扰抗性单克隆。

1.2.3 实验分组和建立肿瘤动物模型 将皮下注射转染空质粒的肾癌细胞的(786-0/si-G250-0)裸鼠作为对照组，转染RNA干扰片段细胞(786-0/si-G250-b)的为实验组，每组6只。对数生长期的786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b细胞经胰酶消化，离心收集，计数后分别重悬于无血清RPMI 1640培养基中，配制成每0.1 ml含5×106个肿瘤细胞的悬液，用1 ml注射器将0.1 ml细胞悬液皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下，每一个部位注射5×106个细胞的悬液。

1.2.4 肿瘤生长情况监测 自肿瘤细胞注射第10天起，每天观察每组裸鼠成瘤时间、成瘤率，待肿瘤出现后每3天一次用毫米游标卡尺测量肿瘤的长、宽、高最大垂直直径(mm)，分别以a、b、c表示，依据肿瘤体积计算公式:V(mm3)=a×b×c/2(mm3)(V:体积)，绘制肿瘤生长曲线。在成瘤后的第3周处死裸鼠，然后测量肿瘤重量，计算肿瘤生长抑制率:肿瘤生长抑制率=(1－处理组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行处理，数据以±s表示成瘤时间、肿瘤重量的比较采取两独立样本t检验，皮下成瘤实验采用重复测量数据的方差分析。

2 结果

2.1 G250基因表达沉默对肾癌786-0细胞体内成瘤的影响

将786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b细胞接种6只裸鼠均成瘤，成瘤率分别为100%。裸鼠肿瘤出现时间分别为(11±1.5)d和(15±2.4)d。显示出实验组的成瘤时间较对照组延长，二者有统计学意义(t=3.381，P=0.007)，说明G250基因表达水平降低后肾癌786-0细胞在动物体内的成瘤能力受到抑制。

2.2 G250基因表达沉默对肾癌786-0细胞移植瘤生长的影响两组裸鼠接种G250基因表达沉默前后的肾癌786-0细胞后，皮下肿瘤生长情况见图1。经重复测量数据的方差分析进行统计学分析，两组之间差异显著(F=8.486，P=0.015)，细胞与时间的交互效应具有统计学意义(F=4.883，P=0.032)，两组细胞7个不同时间肿瘤生长体积的差异具有统计学意义(F=84.836，P=0.000)，说明786-0/si-G250-0组细胞的体内增殖能力显著强于786-0/si-G250-b组，并随天数增加差异加大。

图1 G250基因表达沉默对786-0细胞体内成瘤的影响

2.3 各组裸鼠瘤重、抑瘤率 成瘤3 w后，处死裸鼠，切取肿块称取重量显示:对照和实验组裸鼠的肿瘤重量分别为(37.353±9.332)mg、(22.224 ±5.145)mg，二者有统计学意义(t=3.475，P=0.006)。说明G250基因表达沉默后能抑制肾癌786-0细胞抑制鼠肿瘤的生长，G250基因表达量下降65%时对肿瘤生长抑制率为40.50%。

2.4 肿瘤组织病理改变 裸鼠成瘤组织经HE染色病理切片鉴定均为透明细胞癌，癌细胞排列成腺管状。癌细胞体积大，多边形，轮廓清楚，胞浆富含脂质、糖元而淡染呈空泡状，核稍小而深染，圆形，位于边缘或中央，形态不规则，可见明显的肿瘤细胞。实验组可见少量肿瘤坏死细胞。见图2。

图2 G250基因沉默后786-0细胞移植肿瘤的病理学改变(HE，×200)

3 讨论

肾肿瘤是泌尿系最常见的恶性肿瘤，它起病隐袭，死亡率高。2009年美国统计新发肾肿瘤57 760例，12 980例死亡，占所有新发实体肿瘤的3%〔3〕。肾癌的发生发展与多种癌基因及抑癌基因的异常激活、表达有关。在众多相关研究中，G250是公认的较好的肾透明细胞癌肿瘤相关抗原，但是G250基因表达在肾透明细胞癌发病中的作用尚不明确，研究显示G250基因可能是一种癌基因〔4〕，而且对肿瘤转移有促进作用〔5〕。为进一步了解该基因在肾癌发生、发展中的作用，在成功设计构建、筛选及鉴定G250基因有效siRNA干扰序列的基础上，通过人工诱导RNA干扰(RNAi)技术实现了对G250基因持续稳定的抑制，观察了G250基因表达沉默后对肾癌786-0细胞体内成瘤及生长的影响。

研究显示G250基因表达沉默后，肾癌786-0细胞成瘤时间较对照组明显延长，同一时期肿瘤体积较对照组明显减小，肿瘤重量明显轻于接种正常肾癌786-0细胞组，G250基因沉默对肾癌786-0细胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤的成瘤抑制率为40.5%，说明G250基因沉默能有效抑制肾癌786-0细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，不仅进一步证实G250基因在促进细胞增殖、转化方面有重要的作用〔6〕，也提示该基因的作用可能比我们目前了解的要多，需要进一步探讨。

由于观察到G250基因表达沉默后，体内肿瘤细胞成瘤能力明显下降，造成肿瘤生长速度减慢，说明我们设计的小分子干扰RNA在体内稳定的发挥了作用，导致G250基因沉默，也证实了该技术的持久、高度特异和高效的抑制靶基因表达的优势〔7〕，具有潜在的临床应用价值和前景，同时也提示G250基因有望成为基因治疗的靶点。

1 Li G，Feng G，Gentil-Perret A，et al.CA9 gene expression in conventional renal cell carcinoma:a potential marker for prediction of early metastasis after nephrectomy〔J〕.Clin Exp Metastasis，2007;24(3):149-55.

2 赵俊峰，郑少斌，姜耀东，等.G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定〔J〕.山东医药，2008;48(1):23-5.

3 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics 2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009;59(4):225-49.

4 Bismar TA，Bianco FJ，Zhang H，et al.Quantification of G250 mRNA expression in renal epithelial neoplasms by real-time reverse transcription-PCR of dissected tissue from paraffin sections〔J〕.Pathology，2003;35(6):513-7.

5 Ivanov S，Liao SY，Ivanova A，et al.Expression of hypoxia-inducible cellsurface transmembrane carbonic anhydrases in human cancer〔J〕.Am J Pathol，2001;158(3):905-19.

6 Zavada J，Zavadova Z，Pastorek J，et al.Human tumor-associated cell adhension protein MN/CA IX:identification of M75 eptope and of the region mediating cell adhension〔J〕.Br J Cancer，2000;82(11):1808-13.

7 Wullner U，Neef I，Tur MK，et al.Targeted delivery of short interfering RNAs-strategies for in vivo delivery〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2009;4(1):1-8.