大肠杆菌O111∶B4内毒素对大鼠肝脏Fas蛋白表达的影响

李 勇，高 洪，严玉霖，杨桂梅，彭 洁，孔令青，刘海峰

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.云南省药物研究所GLP中心，云南昆明650111；3.昆明医学院，云南昆明650031；4.云南农业职业技术学院，云南昆明650212)

内毒素(Endotoxin，ET)是革兰氏阴性细菌(Gram negative bacteria，GNB)细胞壁外膜的组成成分，其化学本质为脂多糖(LPS)，它作为GNB的主要致病因子，在GNB感染中发挥着重要作用，常造成人畜ET血症和ET休克，严重危害人畜健康。肝脏既是清除ET的场所，同时又是ET血症、休克过程中最易受损的器官之一[1]。近年来研究表明，细胞凋亡与肝损伤有着密切的联系，在许多肝脏疾病中均有细胞凋亡的发生，它往往通过直接或间接的途径造成肝脏损伤。Fas/FasL系统是目前研究较为深入的一类与凋亡有关的基因系统，而由Fas基因表达的Fas蛋白是一种促凋亡蛋白[2-4]。大量研究表明，Fas/FasL途径是肝细胞的主要凋亡路径[5-8]。而肝细胞凋亡是造成肝损伤的原因之一，Erwei等[9]利用RNA干扰(RNAi)技术，使Fas蛋白表达沉默，凋亡减少，保护肝细胞免受细胞毒性作用，从而避免肝脏受损。而ET能够有效地促进肝细胞凋亡，从而造成肝损伤[10-11]。但在此过程中，ET对大鼠肝细胞Fas蛋白表达的影响尚未见报道。本实验通过建立ET致大鼠肝脏损伤模型，应用western blot和流式细胞术(FCM)，探讨ET对大鼠肝细胞Fas蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、实验动物与仪器 大肠杆菌O111∶B4内毒素(L2630)购自美国Sigma公司；Fas兔多克隆 抗 体(BA0484)、HRP-羊 抗 兔 IgG(BA1054)、β-Actin鼠单克隆抗体(BM 0627)、HRP-羊抗鼠IgG(BA1050)均购自武汉博士德生物公司；异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗兔IgG(ZF-0311)、浓缩型DAB试剂盒(ZLI9017)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；NC膜购自美国M illipore公司；SD大鼠由昆明医学院实验动物科提供；FACS Vantage SE流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品；超速冷冻离心机为美国Beckman Coulter公司产品；DYCZ-24DN型垂直电泳槽和DYCZ-40D转移槽均为北京六一仪器厂产品。

1.2 动物分组、处理与样品制备 48只实验用SD大鼠，体质量140g～160g，雌(无孕)雄不限。临床检查确认健康后，预饲养3d，自由饮水，随机分为2组：第Ⅰ组为试验组(n=24)，按5mg/kg剂量尾静脉注射ET(1mg/m L)；第Ⅱ组为对照组(n=24)，按5m L/kg剂量尾静脉注射无热源生理盐水；两组大鼠分别于3h、4h、8h和12h各迫杀6只，采集肝脏。一部分用于Fas蛋白的western blot检测；另一部分用于Fas蛋白的FCM检测。

1.3 肝脏Fas蛋白的western blot检测 组织经研磨离心后，获得蛋白样品，取适量进行SDS-PAGE电泳，而后转印至NC膜进行western blot检测，一抗为Fas蛋白兔多克隆抗体(1∶300)，二抗为HRP-羊抗兔 IgG(1∶300)， DAB显色，利用 Quantity one 4.6.2软件扫描分析条带灰度值，与内参条带灰度值之比作为结果。

1.4 肝脏Fas蛋白的FCM检测 取适量肝脏组织于200目尼龙筛搓取，将滤液于2000r/min离心5min，清洗两次；加入4%多聚甲醛，室温固定15m in后1800r/min离心5min去上清，清洗；分别加入1∶100稀释的Fas兔多克隆抗体和1∶50稀释的FITC-羊抗兔IgG各避光37℃水浴孵育40m in，并清洗；最后加入冷PBS重悬细胞，调整细胞浓度为 2×106/m L～5×106/m L。取 0.3m L细胞悬液于FACS Vantage SE流式细胞仪，采用Cell quest软件获取细胞并进行测定，以W inMDI2.9软件分析并经计算机处理得出蛋白的表达率。

1.5 统计与分析 各组数据以平均值(X)±标准差(SD)表示，组间差异采取显著性t检验分析。

2 结果

2.1 肝脏Fas蛋白的western blot检测结果 肝脏Fas蛋白表达的western blot检测结果显示，试验组Fas蛋白的表达随时间的推移呈增加趋势(图1)，其灰度值明显高于对照组(p<0.01)，并且始终呈上升趋势(表 1)。

表1 肝脏Fas蛋白的表达结果(灰度值比)(n=6,X±SD)Table 1The expression results of Fas protein in liver(relative values of expression levels)(n=6,X±SD)

2.2 肝脏Fas蛋白的FCM检测结果 检测结果图中横坐标表示细胞大小，纵坐标表示荧光强度，根据强度大小自动换算为信道数值分别以线性和对数形式表示。根据默认值分为4个象限，其中B象限、D象限为细胞团块或多细胞集聚体，C象限为细胞与荧光抗体的非特异结合，所以仅A象限数据为有效表达率。结果显示，Fas蛋白随时间延长表达量增加(图2)；表达率明显高于对照组(p<0.01)，并且呈上升趋势(表2)。

表2 肝脏Fas蛋白的表达结果(表达率，%)Table 2The expression results of Fas protein in liver(expression rates,%)(n=6,X±s)

3 讨 论

ET在动物机体内受血浆和细胞内的多种内源性物质的调节。其中脂多糖结合蛋白(LBP)与LPS刺激肝细胞和巨噬细胞的关系最为密切，LBP与LPS结合为可溶性LBP-LPS复合体，再与肝细胞表面的CD14受体结合并直接作用于肝细胞，从而诱导肝细胞Fas配体(FasL)等基因的表达[12]。

本研究采用western blot和FCM相结合的方法对ET致大鼠肝损伤中Fas蛋白表达的变化进行检测，结果显示：对照组和试验组大鼠肝脏均有Fas蛋白的表达，对照组肝脏Fas蛋白表达均明显低于试验组，并且试验组Fas蛋白表达随着时间的延长而增加。Fas是一种促凋亡蛋白，FasL与Fas的结合导致Fas胞内的死亡域形成三聚体的活化形式，随后引起与之结合的Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)构象发生改变，FADD通过其死亡效应功能区(DED)再与第3个N末端有该同源功能区称为Fas激活的FADD样白介素1-β转化酶(ICE)结合导致后者的活化并被裂解，其裂解产物p10和p20亚基形成异聚体后即成为有活性的半胱氨酸蛋白酶，从而启动ICE相关蛋白酶及caspase级联反应，最终导致细胞的凋亡[13-14]。本研究结果表明在ET作用下Fas蛋白表达随时间推移而增加，而在Fas蛋白的促凋亡作用下，肝细胞的凋亡也随时间的推移而加剧，在一定程度上造成肝脏的损伤。可见ET能够诱导Fas蛋白表达的上调从而促进肝细胞凋亡，是ET致肝损伤的机制之一。

本研究中，试验组Fas蛋白表达随时间推移而逐渐增加，与对照组相比ET明显表现出对Fas蛋白表达的促进作用，而Fas蛋白的促凋亡作用依赖于一系列的信号转导；同样在ET血症及ET性休克过程中也伴随着多条ET信号转导途径，它们彼此之间是否共同作用造成肝损伤？其共同作用的联系如何？以及ET促进Fas蛋白表达更深层的机制又是什么？这些问题还有待于深入的研究和探讨。

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