绞股蓝颗粒对早期糖尿病肾病模型大鼠肾脏NO/NOS表达的影响

金李君 浙江省人民医院中医科 杭州 310014

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，发生率约20%～40%[1]，伴有终末期糖尿病肾病的5年生存率＜20%，是目前糖尿病患者致死致残的主要原因，故早期治疗，延缓其进展，改善其预后至关重要。迄今为止，DN的发病机制尚未完全阐明。近年来，一氧化氮（nitric oxide，NO）及一氧化氮合成酶（nitric oxide synthases，NOS）与DN的关系成为被关注的热点问题。本研究通过观察绞股蓝颗粒对DN大鼠NO及NOS表达的影响，以探讨其治疗DN的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 健康SPF级SD大鼠48只，体重180～220g，雌雄各半，由浙江中医药大学实验动物中心提供并饲养，合格证号：SCXK（沪）：2003－0003。

1.2 药品与试剂 绞股蓝颗粒（1g/包，相当于生药10g）由浙江省中医院中药制剂室提供；缬沙坦胶囊（商品名：代文，规格：80mg/粒，国药准字H20040217）由诺华制药有限公司提供；链脲佐菌素（streptozin，STZ）由美国Sigma公司提供；RT－PCR反应试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司提供；Trizol裂解液由美国GIBCOBRL公司提供；NO及NOS试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

2 实验方法

2.1 模型建立与分组 随机选取8只大鼠行左侧肾摘除假手术操作，然后按5mL/kg尾静脉注射pH4.4的柠檬酸缓冲液，作为正常对照组，其余40只大鼠按文献[2]单侧肾切除加STZ注射法改良复制DN模型。将DN模型大鼠随机分为绞股蓝颗粒低剂量组（0.15g/kg）、绞股蓝颗粒中剂量组（0.3g/kg）、绞股蓝颗粒高剂量组（0.6g/kg）、缬沙坦组（8mg/kg）和模型对照组，每组8只。绞股蓝颗粒、缬沙坦粉均用生理盐水配制成溶液，各组按上述剂量灌胃，大鼠每3天测量1次体质量，根据各组大鼠的平均体质量配制相应浓度的溶液。大鼠灌胃给药，1天1次，1次1.5mL，连续4周；正常和模型对照组灌胃等体积的生理盐水。

2.2 标本采集 各组大鼠分别于治疗第4周末留取24h尿液，记尿量，用于测定尿肌酐和尿微量白蛋白；下腔静脉抽取静脉血，分装用于检测空腹血糖、血脂、血肌酐、尿素氮。处死后开腹取肾，用于测定NO含量、NOS活性及诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 血糖、血脂、血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24h尿微量白蛋白 采用日本日立7170型全自动生化仪测定，并计算内生肌酐清除率。

2.3.2 肾脏肥大指数 肾脏肥大指数=肾重/体质量×103。

2.3.3 肾组织NO含量 按试剂盒说明进行操作。

2.3.4 肾组织NOS活性 按试剂盒说明进行操作。

2.3.5 肾组织iNOS mRNA表达 由基因库分别查得大鼠iNOSmRNA核苷酸序列，Primer Premier计算机软件辅助引物设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，iNOS上游引物：5’－ATC CCG AAA CGC TAC ACTT－3’，下游引物：3’－TCT GGC GAA GAA CAA TCC－5’。取肾皮质 100mg，Trizol法提取总RNA，取总RNA2μg，按逆转录操作说明书逆转录成cDNA，取逆转录产物及iNOS上下游引物各1μL加入PCR反应液，按以下条件在PCR仪中进行PCR反应.：95℃预变性5min；然后按下述条件循环35 次：94℃ 40s、60℃ 40s、72℃ 90s，72℃ 10min，4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析系统进行灰度扫描。

3 结 果

3.1 一般情况 正常组大鼠体质量增加明显，精神状态良好，反应灵敏，皮毛有光泽，动作自如，模型组大鼠具有典型“三多一少”的表现，且精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，动作迟缓，弓背蜷体；各治疗组大鼠表现较模型组明显减轻。

3.2 绞股蓝颗粒对DN大鼠各项生化指标及肾肥大指数的影响 结果见表1、2。

表1 各组大鼠生化指标比较（±s） mmol/L

表1 各组大鼠生化指标比较（±s） mmol/L

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与缬沙坦组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别n/只血糖甘油三酯总胆固醇尿微量白蛋白/（mg/24h）绞股蓝低剂量组 8 20.29±1.19▲▲*△△ 3.02±0.17▲▲** 2.35±0.13▲▲** 17.23±0.58▲▲*△绞股蓝中剂量组 8 20.20±0.86▲▲*△△ 2.61±0.15▲▲*△△ 2.18±0.12▲▲**△ 16.90±0.47▲▲**绞股蓝高剂量组 8 18.59±1.20▲▲*△△ 2.36±0.12▲**△△ 2.01±0.15▲▲**△△ 16.13±0.66▲▲**缬沙坦组 8 23.89±1.04▲▲ 3.22±0.19▲▲ 2.53±0.13▲▲ 16.28±0.73▲▲**模型组 8 24.31±1.82▲▲ 3.25±0.18▲▲ 2.61±0.16▲▲ 18.31±1.73▲▲正常组 8 6.13±0.78 2.16±0.17 1.25±0.11 6.13±1.08

表2 各组大鼠生化指标比较（±s）

表2 各组大鼠生化指标比较（±s）

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与缬沙坦组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别n/只血肌酐/（μmol/L）尿素氮/（mmol/L）内生肌酐清除率/（mL/min）肾脏肥大指数绞股蓝低剂量组 8 72.74±9.54▲▲**△ 13.63±0.90▲▲*△ 2.37±0.11▲▲**△△ 6.56±0.56▲▲*△绞股蓝中剂量组 8 70.84±10.21▲**△ 12.38±1.18▲▲** 2.16±0.10▲▲** 6.38±0.52▲▲**绞股蓝高剂量组 8 68.84±12.15▲**△△ 11.25±0.99▲▲**△ 1.82±0.12▲▲**△△ 5.99±0.47▲▲**缬沙坦组 8 82.99±7.97▲▲ 12.48±1.19▲▲** 2.05±0.15▲▲** 5.99±0.34▲▲**模型组 8 86.95±6.59▲▲ 14.79±0.97▲▲ 2.56±0.17▲▲ 7.02±0.31▲▲正常组 8 59.49±7.76 6.59±1.03 1.00±0.09 3.47±0.28

3.3 绞股蓝颗粒对DN大鼠NO含量、NOS活性及 iNOS mRNA表达的影响 见表3

表3 各组大鼠肾组织NO含量、NOS活性及iNOSmRNA表达量比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织NO含量、NOS活性及iNOSmRNA表达量比较（±s）

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与缬沙坦组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 n/只 NO（μmol/g） tNOS（U/mg） iNOS（U/mg） iNOSmRNA/GAPDH绞股蓝低剂量组 8 1.86±0.12▲▲*△△ 1.28±0.12▲▲△△ 0.48±0.04▲▲**△△ 0.75±0.08▲▲*△△绞股蓝中剂量组 8 1.66±0.08▲▲**△ 1.16±0.10▲▲**△ 0.42±0.03▲▲**△ 0.64±0.07▲▲*△绞股蓝高剂量组 8 1.52±0.12▲▲** 0.97±0.13▲▲** 0.35±0.06▲▲** 0.57±0.06▲▲**缬沙坦组 8 1.53±0.11▲▲** 1.01±0.09▲▲** 0.36±0.04▲▲** 0.56±0.05▲▲**模型组 8 1.97±0.12▲▲ 1.40±0.16▲▲ 0.61±0.07▲▲ 0.87±0.13▲▲正常组 8 0.71±0.09 0.53±0.09 0.18±0.03 0.44±0.07

图1 各组大鼠肾组织iNOS mRNA表达

4 讨论

DN病因及发病机制十分复杂，目前认为其发生和发展是由于糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、高血压、血流动力学异常、细胞因子分泌异常、反应氧中间产物和遗传因素等综合作用的结果。高葡萄糖可通过各种机制[3]，如增加产生的氧化应激和晚期糖基化终产物，活化的ras基因和蛋白质激酶C，以及刺激多元醇通路，诱发血管炎症和改变基因表达的生长因子和细胞因子，从而发展成为DN。研究证明，DN患者脂代谢紊乱的程度明显高于无肾病患者[4]。脂质在肾脏沉积可引起肾小球基底膜增厚，细胞外基质聚集，进一步导致肾小球硬化和肾小管损伤，最终导致肾功能受损[5]。高脂血症促进DN的发生和发展，糖尿病则加重血脂紊乱，最终形成恶性循环，故控制血糖、血脂是防治DN的基础措施。本实验结果显示，绞股蓝颗粒能明显降低实验DN大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇（P＜0.05 或 P＜0.01），说明绞股蓝颗粒具有改善DN糖脂代谢的作用，对防治糖脂毒性造成的严重肾脏损害有着重要意义。

NO是在NOS作用下，将L－精氨酸转变为L－胍氨酸过程中的氧化产物，由于NO的代谢速度很快，半衰期极短，体内NO合成的主要限速因素是NOS。NOS有三种亚型，分别为神经型NOS、内皮型NOS、i－NOS。前两者为细胞所固有，又称为结构型NOS（cNOS），依靠Ca2+/钙调蛋白激活，在生理状态下可按机体的需要，产生短暂性、少量的NO脉冲释放，功能主要为细胞间信号传递；而iNOS的活性不依赖于Ca2+/钙调蛋白，而需要诱导因子如内毒素、干扰素、白介素等存在，在病理状态下才表达，且不受限制，催化作用时间长，产生的大量NO，参与病理生理过程，造成组织细胞损伤，并引起血流动力学改变[6]。研究表明，糖尿病状态下，多种因素可使iNOS被诱导而表达增加[7]，诱导后iNOS活性较cNOS合成的NO浓度高1000倍[8]，是引起体内NO过量产生的主要基础。NO是一种具有强烈扩血管作用的物质，由于其对肾脏入球小动脉舒张作用远远大于出球小动脉，因此，肾脏局部大量生成的NO可使肾小球内压升高，肾小球高滤过、高灌注形成。而糖尿病早期肾小球的高滤过和高灌注是DN发生的始动因素，久之便导致系膜细胞肥大与基质的增生，最后发生肾小球硬化。此外，NO还通过形成过氧化亚硝基阴离子（ONOO－）和氢氧根自由基诱导氧化应激，导致组织损伤。高水平的NO还可损伤线粒体、含铁硫蛋白酶和DNA，直接导致细胞死亡。

中医认为，DN为脾肾虚损、浊毒潴留、肾络瘀滞所致，乃“本虚标实”之证。绞股蓝味苦，微甘，性寒，入脾、肺、肾经，功善益气健脾，滋阴益肾，养心安神，消痰化瘀，与DN的病机特点吻合。其作为五加科以外的唯一含有人参皂苷相似结构有效成分的植物，化学成分主要为绞股蓝皂苷、黄酮类、多糖类，还有脂肪、蛋白质、氨基酸、纤维素、维生素等多种成分，药理活性广泛。Ke Norberg等[10]发现，绞股蓝除了能够降低血脂、血糖、提高免疫功能外，还能够促进胰岛素释放。绞股蓝颗粒是在绞股蓝饮片的基础上发展的一种新剂型，具有功效成分含量高，服用量少，服用、携带方便，可与其他中药颗粒配伍灵活应用等优点。绞股蓝具有肾脏保护作用，孙万森等[11]研究发现，绞股蓝皂苷能降低慢性肾功能衰竭患者的血脂，升高血红蛋白，改善肾功能及保护肾脏。黄萍等[12]研究发现绞股蓝可直接干预DN的多个发病环节，具有降血脂、降低尿微量白蛋白排泄率等作用，对DN有明确的肾保护作用。本实验结果表明，与正常大鼠比较，DN大鼠肾组织中NO含量明显增高及tNOS、iNOS活性明显上升，iNOS mRNA表达明显上调。而绞股蓝颗粒能有效降低DN大鼠肾组织NO含量及tNOS、iNOS活性，并下调DN大鼠iNOS mRNA表达。考虑绞股蓝颗粒对DN大鼠的部分肾脏保护作用，可能是介导调节NO含量、NOS活性及iNOS mRNA表达来实现的。至于绞股蓝颗粒是否对cNOS的表达起作用，以及是否还通过其他途径来实现其对早期DN的肾脏保护作用，都有待进一步深入研究。

［1］American Diabetes Association.Position statement:Diabetic nephrophathy［J］.Diabetes Care，2006，21:s50.

［2］杨俊伟，李磊石，张真.大黄治疗糖尿病肾病的实验研究［J］.中华内分泌代谢杂志，1993，9（4）：222-224.

［3］Fukami K，Yamagishi S，Ueda S，et al.Novel therapeutic targets for diabetic nephropathy［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2007，7（2）:83-92.

［4］王英，江从海，王惠英，等.血脂异常对2型糖尿病肾病的影响［J］. 中国热带医学，2008，8（6）：981-982.

［5］Wang Z，Jiang T，Li J，et al.Regulation of renal lipid metabolism，lipid accumulation，and glomerulo sclerosis in FVB db/db mice with type 2 diabetes［J］.Diabetes，2005，54:2328.

［6］廖琳，陈青，李国安，等.一氧化氮和一氧化氮合酶基因多态性与糖尿病肾病［J］.国外医学内科学分册，2005，32（10）:436.

［7］Poljakovic M，Nygren JM，Persson K.Signalling pathways regulating inducible nitric oxide synthase expression in human kidney epithelial cell［J］.Eur J Pharmacol，2003，47（2）：101.

［8］Dzurik R，Spustova V.Nitric oxide and the kidneys［J］.Vnitr Lek，2001，47（2）：101.

［9］Veelken R，Hilgers KF，Hartner A，et al.Nitricoxide synthase isoforms and glomerular hyperfiltration in early diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2000，11（1）:71－79.

［10］Ke Norberg，Nguyen Khanh Hoa，Edvards Liepinsh，et al.A Novel Insulin-releasing Substance，Phanoside，from the Plant Gynostemma pentaphyllum［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，299（40）：41361-41367.

［11］孙万森，吴喜利，乔成林．绞股蓝总皂苷治疗慢性肾功能衰竭［J］．浙江中医学院学报，2004，28（2）：24-25.

［12］黄萍，陈竞龙，张雷，等．绞股蓝总甙对2型糖尿病肾病的血脂、微量白蛋白尿的影响［J］．中国现代医学杂志，2007，17（2）：206－208.