响应面法优化黑曲霉产木聚糖酶发酵条件的研究

马晓建，杨君芳，常 春

(郑州大学化工与能源学院，河南郑州450001)

0 引言

木聚糖酶能将自然界中含量丰富的木聚糖降解为低聚木糖、木糖及少量其他单糖，在农业、食品工业、造纸工业、饲料工业等领域具有广泛的应用［1］.木聚糖酶可由自然界中广泛存在的真菌、放线菌、细菌、酵母菌等微生物发酵产生.而黑曲霉生长迅速、发酵周期短，且发酵过程不产生毒素、安全、可靠，是公认安全的微生物，具有明显的优越性［2-3］.因此，选育高产木聚糖酶的黑曲霉菌株并对其发酵工艺条件进行优化，有助于开发、研制木聚糖酶制剂，是当前国内外研究热点之一.

目前，用于优化发酵条件的数学统计方法有很多，比如正交实验法和响应面分析(Response Surface Methodology，RSM)［4］.响应面分析比正交实验法更为有效，因为它采用了更为经济的方式和更为合理的实验设计方案，考虑实验的随机误差，对实验进行更为全面的分析，在化学工业、生物学、医学以及食品学等领域得到广泛的应用［5-6］.为此，笔者通过液态发酵筛选得到一株产木聚糖酶的黑曲霉菌株，并运用响应面分析方法对其培养条件进行了初步优化，为进一步的放大研究提供参考.

1 材料和方法

1.1 出发菌种

黑曲霉(Aspergillus niger)：郑州大学生化中心实验室保存.

1.2 培养基

斜面及平板培养基 PDA：去皮马铃薯200 g切成小块加入1 000 mL水煮沸30 min，然后用纱布过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂20 g，溶化后补足水至1 000 mL，pH自然，121℃灭菌30 min.

液体筛选培养基(g/L)：麸皮15 g，蛋白胨10 g，KH2PO430 g，NaNO330 g，CaCl25 g，MgSO4·7 H2O 5 g，FeSO4·7 H2O 0.007 5 g，MnSO4· H2O 0.002 5 g，ZnSO40.02 g，CoCl20.03 g［7］.

发酵条件优化培养基(g/L)：玉米芯20 g，麸皮 10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，(NH4)2SO41.4 g，KH2PO42 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，FeSO4·7 H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·7 H2O 0.001 4 g，CoCl2·6 H2O 0.003 7 g［8］.

1.3 主要仪器

电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);标准型洁净工作台(上海博迅实业有限公司);隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);PHS-3C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司);722N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司).

1.4 菌种的分离和筛选

(1)菌种活化.采用PDA斜面活化出发菌株，接种后于30℃恒温培养箱中培养3 d.

(2)菌种筛选.用接种环从活化后菌种斜面上取2环孢子接入液体培养基中，于30℃，150 r/min的条件下培养4 d，然后测定菌种的酶活.

1.5 酶活测定方法

木聚糖酶活的测定

取1 mL1.0%的木聚糖溶液(溶于pH=4.8乙酸缓冲液中)于10 mL的刻度具塞试管中，再准确加入0.5 mL一定稀释度的待测酶液(空白管不加)，50℃水浴30 min后，立即加入2 mL DNS试剂，再于空白管中准确加入0.5 mL一定稀释度的待测酶液.充分混匀后，置于沸水浴中5 min，然后迅速取出冷却至室温，加蒸馏水定容至10 mL，摇匀.样品在波长540 nm下测定吸光度，将吸光度平均值代入线性回归方程求出木糖的含量.

木聚糖酶活力定义单位：在上述条件下，每小时分解底物释放出1 μmol木糖所需要的酶量为一个单位(U/mL).

1.6 发酵条件优化设计方法

本实验采用响应面分析的方法对黑曲霉产木聚糖酶的发酵条件进行优化.

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选

将编号 F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、G-1、G-2、G-3、G-4、G-5，共 10 株黑曲霉菌株接入液体筛选培养基中，通过测定木聚糖酶活来筛选高产木聚糖酶的菌株.筛选结果见图1.从图1中可以看出：F-3的酶活最高，为162.20 U/mL，因此最终选定F-3为实验菌株，进行下面的优化实验.

图1 黑曲霉筛选结果Fig.1 Screening results from Aspergillus niger

2.2 发酵条件的优化

根据RSM实验设计方案［9］并参考预试验的结果，选取发酵温度、发酵时间和起始pH为考察因素，分别设为X1、X2、X3，每个因素取3个水平，共设计了15个实验点的响应面分析实验，其中12个为析因点，3个为零点，零点实验进行了3次，以估计误差.以每毫升酶液的木聚糖酶活力作为响应值Y.实验因素水平见表1，响应面实验设计与结果见表2.

表1 实验因素水平表Tab.1 Experimental factors and levels

表2 响应面实验设计与结果Tab.2 Experimental design and results of RSM

利用SAS软件运行表2中的数据，得到的回归方程为

上述方程的决定系数R2=0.900 4，表明回归方程的拟合程度良好.回归方程的方差分析表见表3.

表3中P值为显著性概率，当小于0.05时说明影响显著，小于0.01时影响高度显著.因此，X1的一次项、X1的平方项显著;X2的一次项不显著、X2的平方项显著;X3的一次项不显著、X3的平方项高度显著，这说明3个考察因素对木聚糖酶产量都有一定的影响，但方差分析中交互项不显著，这说明可以不考虑3个考察因素的交互作用［10］.

表3 方差分析结果Tab.3 The results of analysis of variance

发酵时间、温度和起始pH值3个因素的响应面分析图分别见图2、图3、图4.

图2 X1，X2对Y值响应面分析图(X3=0)Fig.2 Analysis of the RSM of Y=f(X1，X2)

从图2可以看出发酵温度X1、发酵时间X2对黑曲霉F-3液态发酵产木聚糖酶酶活的影响，在最优点处X1、X2无论是增加或减少都对黑曲霉产木聚糖酶的酶活有消极影响［11］.

由图3可见黑曲霉F-3液态发酵产木聚糖酶的酶活随发酵温度X1、起始pH值X3的增大呈现先增大后减小的趋势，在发酵温度为30℃、起始pH为4.85左右时，木聚糖酶酶活最高.

图4为Y1=f(X2，X3)的响应面分析图(X1=0)，反映出类似上述的变化规律，在发酵时间为98 h左右、pH为4.85时，木聚糖酶酶活最高.

对利用SAS软件得到的回归方程求一阶偏导并使其等于零，可得到响应面的最大值.即3个因素的最佳值：温度为30.8℃、发酵时间为98.7 h、起始pH为4.85，此时木聚糖酶酶活最优值为265.08 U/mL.按上述的最佳条件做验证实验，最终测得的酶活结果见表4.

表4 验证实验结果Tab.4 The results of validation experiment U/mL

3 结论

通过液态发酵筛选得到一株高产木聚糖酶的黑曲霉菌株F-3，其最高酶活为162.20 U/mL.利用响应面分析的方法对黑曲霉菌株F-3的发酵温度、发酵时间和起始pH进行了初步优化，确定了其最优发酵条件为温度30.8℃、发酵时间98.7 h、起始pH值为4.85，使其产木聚糖酶的最高酶活可达266.41 U/mL，比之前提高了64.25%.

［1］闫振丽，程杰渊，杨付伟，等.黑曲霉固态生产木聚糖酶发酵条件的优化［J］.中国酿造，2009，(4)：99.

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