水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNA去甲基化作用研究

田雪飞 ，孙 婧 ，方 圆 ，伍参荣 ，周 青 ，廖兴华

（1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学基础医学院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

DNA甲基化是复制后的修饰，在细胞增殖、分化过程中起重要作用。肝癌相关抑癌基因，例如P16基因等启动子区域的CpG岛甲基化，在肝癌的发生发展过程中起着重要的作用[1]。已有部分研究证实中药成分槲皮素[2]、CDP成分[3]及复方左金丸[4]等具有降低抑癌基因甲基化水平的作用，提示探索中药DNA去甲基化作用对中医药抗肿瘤研究具有重要的意义。前期研究中我们发现水蛭提取物具有体外抑制肝癌HepG2细胞增殖及诱导凋亡的作用[5]，为此本实验通过观察水蛭提取物对肝癌细胞甲基转移酶（DNMTs）表达的影响，研究中药有效成分的DNA去甲基化作用，进一步探讨水蛭提取物的抗肝癌作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 水蛭购于湖南中医药大学第一附属医院，并由湖南省中医药研究院超微工程中心制备成水蛭超微粉。提取物参照研究组前期建立的液氮快速冻融法制备[5]：取水蛭超微粉1.5 g置15 mL离心管内，加10 mL灭菌双蒸水制成混悬液，再将离心管置液氮内5 min取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重复3次，3 000 r/min离心10 min，取上清液0.22μm微孔滤膜滤过，冷冻干燥18 h即得水蛭提取物冻干粉，-20℃保存备用。

1.1.2 试剂 Trizol RNA提取试剂为美国Gibco公司产品，RT-PCR相关试剂及引物为大连宝生物工程有限公司产品或合成；胎牛血清、低糖DMEM培养基干粉为Gibco公司产品；5-脱氧杂氮胞苷 （5-Aza-cdR）为Sigma公司产品。兔抗人DNMT1、DNMT3a、DNMT3b多克隆抗体购自美国Abcam公司；二抗为生物素标记的羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3 细胞株 人肝癌细胞株HepG2购自中南大学湘雅细胞中心并保存。

1.1.4 仪器 倒置荧光显微镜 （日本OLYMPUS公司）；自动酶标仪（奥地利TECAN公司）；CO2培养箱（美国Hitachi公司），基因扩增仪（中国杭州大和热磁力电子公司）；凝胶电泳仪（中国杭州博日科技公司）；凝胶图像分析系统（中国上海天能科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2培养于含10%小牛血清，100 U/mL链霉素和青霉素的DMEM培养液中，37℃，饱和湿度和5%CO2条件下培养，2～4 d更换培养基1次，常规传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 药物干预浓度及分组 HepG2细胞接种24 h后分别用水蛭提取物、5-Aza-cdR处理。水蛭提取物临用前用含10%小牛血清的DMEM细胞培养液溶解稀释成工作浓度。根据预实验结果确定工作浓度为 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/mL；5-Aza-cdR临用前用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液稀释成工作浓度，根据文献[6]及预实验结果确定工作浓度为 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 μM；DNMTs 表达检测以MTT检测1/2 IC50含药量作为工作浓度；均采用未加药物处理的细胞作为对照组。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期HepG2细胞接种96孔板，每孔接种2×104个细胞，分别培养48 h后每孔加入5 g/L MTT 10μL，37℃条件下继续培养4 h，弃上清液，每孔加入100μL DMSO，酶标仪波长490 nm处检测吸光度A值，实验重复3次。按下列公式计算细胞抑制率：细胞生长抑制率（%）=（对照孔A值-试验孔A值）/对照孔A值×100%。根据不同药物浓度条件下细胞生长抑制率数值进行相关回归分析，并根据回归方程计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.4 RT-PCR 法 检 测 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达 取对数生长期1×106个HepG2细胞接种于培养瓶，培养6 h待贴壁后，换含水蛭提取物、5-Aza-cdR（IC50含药量）的培养基处理，对照组以不含药物的培养基处理。继续培养48 h后收集细胞，总RNA提取按Trizol试剂盒说明进行，紫外分光光度计测定总RNA浓度与纯度，-70℃保存备用。逆转录取2μL总RNA，10mM Oligo dT 1μL，用DEPC水补至总体积12μL，70℃ 5 min，冰上骤冷后加入5×buffer 4μL，20 mU/L RNA酶抑制剂 1 μL，10 mM dNTP 2 μL， 200 mU/L MMLV 1 μL，37 ℃ 反应 60 min，94 ℃灭活 5 min。PCR序列根据 Genebank中人 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、GAPDH cDNA序列进行设计。PCR反应体系为总体积 25μL，其中 10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.2mM， 上下游引物各 0.5 mM，MgCL21 mM，Taq酶 0.25 μL，cDNA 模板 2 μL，余下用无菌ddH2O补足，引物序列及PCR反应条件见表1。取PCR产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶上电泳 (含0.5 mg/L溴化乙锭)，PCR条带应用Eagle EyeⅡ图像分析处理系统分析结果，基因的相对表达水平等于该基因RT-PCR产物电泳条带的灰度值/GAPDH RT-PCR产物电泳条带的灰度值。

表1 PCR引物序列、反应条件及扩增的目的片段大小

1.2.5 免疫组化法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达 对培养贴壁细胞洗脱涂片于已消毒的载玻片上，37℃过夜；PBS液轻洗，用冷丙酮固定5 min，自然干燥，SABC法免疫组织化学染色(操作流程按说明书进行)。显微镜下观察DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白染色和在细胞中的分布情况。并对每组标本计数300个细胞，计算染色阳性比率。

1.3 统计学分析

所有数据均采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析，数值变量资料以“x±s”表示，采用单因素方差分析，组间均数比较采用q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。IC50采用直线相关回归分析，根据回归方程计算求出。

2 结果

2.1 水蛭提取物、5-Aza-cdR对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的影响

MTT实验结果显示，水蛭提取物、5-Aza-cdR以剂量依赖性方式抑制HepG2细胞增殖,增殖抑制率随水蛭提取物、5-Aza-cdR的浓度增高而增加。水蛭提取物、5-Aza-cdR各剂量组吸光度OD值与对照组比较差异均有显著统计学意义（P＜0.01）。求出直线回归方程水蛭提取物为y(增殖抑制率)=7.587x（药物浓度）+7.488，计算可得作用HepG2细胞48 h时的水蛭提取物半数有效抑制浓度IC50=6.0 mg/mL，因此确定3 mg/mL为水蛭提取物进行下一步试验的工作浓度；直线回归方程5-Aza-cdR为 y(增殖抑制率)=55.357x（药物浓度）-3.029，计算可得作用HepG2细胞48 h时的5-Aza-cdR半数有效抑制浓度IC50=0.96μM，因此确定0.48μM为5-Aza-cdR进行下一步试验的工作浓度。见表2。

表2 水蛭提取物、5-Aza-cdR处理48 h后对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用

2.2 水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达的影响

水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达有抑制作用，IC50药物浓度下处理 48 h 后，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达降低，与对照组比较两者间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照 5-Aza-cdR 组比较，对 DNMT1 mRNA 表达降低要弱于对照组（P＜0.05），但水蛭提取物抑制DNMT3a、DNMT3b mRNA表达的作用要强于5-Aza-cdR，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 3，图 1～3。

图1 RT-PCR扩增肝癌细胞HepG2 DNMT1 mRNA表达电泳图

图2 RT-PCR扩增肝癌细胞HepG2 DNMT3a mRNA表达电泳图

图3 RT-PCR扩增肝癌细胞HepG2 DNMT3b mRNA表达电泳图

2.3 水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达的影响

对照组 HepG2 细胞 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达依次为DNMT1高度表达，而DNMT3a、DNMT3b分别中、低度表达。经水蛭提取物处理后，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 表 达 明 显 降低 ， 尤 其DNMT3b表达降低最为明显，与对照组比较差异有显著统计学意义 (P＜0.01)，与阳性对照5-Aza-cdR组比较，DNMT1表达要高，但降低DNMT3a、DNMT3b效果明显优于5-Aza-cdR组，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。 数据见表 4。

表3 水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平的影响（灰度值，目的基因/GAPDH）

表4 水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达水平的影响 （光密度值，）

表4 水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达水平的影响 （光密度值，）

组 别水蛭提取物组5-Aza-cdR组对照组DNMT1 562±183**△△323±241**1127±355 DNMT3a 496±164**△624±201*873±352 DNMT3b 182±84**△△341±127*483±212

3 讨论

虽然肝癌细胞发生甲基化异常的模式目前仍不清楚， 但 DNMTs， 包括 DNMT1，DNMT3a，DNMT3b已被证实在肝癌细胞内存在表达异常[6-7]。其中DNMT1在正常细胞S期复制过程中具有维持甲基化的功能，多数表现为散在的C被甲基化，而CpG岛未被甲基化[8]。DNMT1高表达是CpG岛甲基化紊乱的重要因素之一，DNMT1高表达总是伴有总基因组DNA低甲基化和癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基化。通过siRNA靶向抑制DNMT1表达后肿瘤相关基因启动子如RASSF1A、p16等可发生去甲基化而重新表达[9-10]。

有报道及我们本课题组前期研究结果表明水蛭可通过直接杀伤、诱导分化及凋亡等机制发挥抗肿瘤作用[5,11]，能否通过DNA去甲基化作用发挥抗肿瘤作用是值得研究的问题。本研究发现，水蛭提取物对肝癌HepG2细胞具有增殖抑制作用，且具有剂量依赖性。HepG2细胞中DNMT1基因表达明显增高，DNMT3a、DNMT3b基因呈中、低度表达。而经IC50浓度的水蛭提取物处理后 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因表达显著降低，尤其可完全抑制DNMT3b基因的表达，其蛋白表达也呈弱阳性。虽然水蛭降低DNMT1表达作用远低于对照药物甲基化转移酶抑制剂5-Aza-cdR，但降低DNMT3a、DNMT3b的作用要优于5-Aza-cdR。结果表明DNA去甲基化作用可能是水蛭提取物抗肿瘤的机制之一，也提示从抗肿瘤中药中筛选DNA去甲基化中药有效成分具有可行性。

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