实验室新鲜血液防腐剂使用方法探索

刘卫东

（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）

我们实验室是1998年由生理学、药理学、病理生理学三学科的实验室合并而成，目前主要承担生理学、药理学和一部分病理学的实验教学任务。实验教学工作中大量使用活体动植物及其生鲜制品，比如小白鼠、血液制品、皂苷等，这些物品在使用过程中容易受到细菌污染及空气中的氧气氧化等因素的影响，造成物质损耗，并造成实验现象改变，影响教学效果［1］。为了延长物品的使用时间，节约实验成本，往往需要使用一些有防腐、保鲜作用的物质。我国在食品和药品中允许使用的防腐剂有32种，但是常用的防腐剂主要有苯甲酸和苯甲酸钠、山梨酸和山梨酸钠、丙酸钙、乳酸链球菌素等等，而在实验室中，由于为非食用用途，因此一些非食用类物质也可以当作防腐剂来使用，比如甲醛、氟化钠等。这些物质的使用可以参照国家食品、药品管理规定中有关防腐剂、保鲜剂的相关规定，但更多的需要在实践中逐步摸索。我们对于一些常见的非食用类物质对血液的防腐的影响通过实验进行了观测。

作为有重要生理功能的血液及其制品在多个实验项目中都要用到，血液成分十分复杂，在实验中可以分为血浆组成和性质实验、细胞结构和分类实验、血液功能实验等。不同实验中对防腐均有不同的要求，比如血红蛋白结合氧的实验和一氧化碳毒性实验中只需要保护血红蛋白部分不改变活性［2］，同时尽量保护红细胞的形态，而对于血浆成分的要求不高，只要不发生明显的腐败变质现象干扰实验就可以了。由于商业血液制品中已经含有一定量的防腐剂，但一般仅限于开封之前在生产、运输和保存过程中的防腐，如果开封后不能立即用完，或实验室现采的血液，均需要加入一些防腐剂。

由于蛋白质是血液功能的主要承载者，也是比较容易受到细菌作用而变质的部分，因此我们主要研究防腐剂对血液中蛋白质的影响。由于血红蛋白的含量较高，且在多个实验项目中都有应用，我们选择血红蛋白进行测试，但直接测定血红蛋白有困难，而CO与血红蛋白结合后有比较强的紫外吸收，可以根据吸光系数的变化判断血红蛋白是否已经变质［3］。我们选择了实验室中常用的甲醛、氟化钠、乙二胺四乙酸二钠、亚硝酸钠、草酸钾、肝素钠、柠檬酸钾及氟化钠与草酸钾混合物（1：3）8种试剂，按常用浓度分别添加到血样品中，并于添加后的0 h、2 h、8 h、24 h、3 d、7 d用紫外可见光分光光度法检测其中Hb-CO饱和度。本实验所用的所有药品均为分析纯。所用的浓度：10%甲醛1：9（体积浓度），氟化钠8 mg/mL，乙二胺四乙酸钠2 mg/mL，亚硝酸钠0.15mg/mL，草酸钾2 mg/mL，肝素钠200 IU/mL，氟化钠和草酸钾（1：3）混合液4 mg/mL，柠檬酸纳5 mg/mL。

1 实验方法

1.1 饱和HbCO血液样本制作 取500 mL新鲜血液，向其中缓慢通入甲酸与浓硫酸共热［4］产生的CO 30 min，制成被CO饱和的血液，此时血液呈樱桃红色，再向血样中通入10 min N2，用来带出多余的CO，然后取同一血液样本将饱和血稀释至需要的浓度。

1.2 样本处理与检测 设添加组和空白对照组共9组样品，在室温下用安瓿瓶存放在阳光无法直射处，分别保存0 h，2 h，8 h，24 h，3 d和7 d时间下在533 nm处检测其摩尔吸光系数，并计算各组血样中Hb-CO的相对饱和度。

1.3 工作曲线的绘制 将完全饱和CO的血液的HbCO饱和度视为100%，按体积比配制成理论Hb-CO饱和度分别为5%、10%、20%、40%、60%、80%、100% 的浓度系列，用上述方法检测得实测值，利用理论值与实测值绘制标准工作曲线。

2 结果

2.1 颜色变化 通入CO的血液因HbCO的生成而显樱桃红色，随着通气时间的延长，HbCO饱和度增加，樱桃红色逐渐趋于明显，通气约25m in后樱桃红色趋于稳定且不再变化。实验血样加入氟化钠后樱桃红色变得鲜艳，到7d，血液变成暗红色；加入氟化钠：草酸钾（1：3），血液颜色变得鲜艳；加入亚硝酸钠血液变为暗褐色，似酱油状；加入甲醛、乙二胺四乙酸二钠、草酸钾、肝素钠、柠檬酸钾血液樱桃红色变化不明显，7d后变为暗红色。

2.2 HbCO饱和度稳定性检验 将空白血样0h时的摩尔吸光系数为基准值，其他样品测得的数值为相对数值，每份样品均测定5次，求算术平均值，结果均保留小数点后一位［6］，检验结果见表1。

表1 各时间段HbCO饱和度平均值

3 讨论

从空白对照血样的数据看，血液腐败在最初的两小时内比较慢，此后迅速加快，8 h后即明显变质。由于实验用样品开封后一般在一天内做完，因此最有价值的防腐作用是在2～8 h内抑制样品的腐败变质。氟化钠是一种强效代谢抑制剂，氟离子可以与多种蛋白结合，并能抑制琥珀酸脱氢酶，致使氧化作用下降，影响细胞呼吸功能并造成一部分红细胞解体。这可能是加入氟化钠后血液变的更加鲜红的原因，从数据上看加入氟化钠后吸光系数略微增大，且基本保持稳定，说明氟化钠的加入明显的抑制了样品的腐败过程，尤其是在最初的1 d时间内，效果很显著。

甲醛是一种毒性较强的物质，可以与血红蛋白中的铁离子作用，使吸光系数发生明显变化［7］。甲醛是原浆毒，可与蛋白质、氨基酸及核酸发生烷化、甲基化等使蛋白质凝固，形成不溶物沉淀，从而降低机体内氨基酸、核酸的浓度，并对测试有一定的干扰，经过离心后仍对实验有一定影响。

亚硝酸钠中的N为+3价，同时具有氧化性和还原性，可以氧化血红蛋白中的二价铁离子为三价的高铁离子，使血液变为暗褐色，并使吸光系数发生较大改变。同时亚硝酸钠毒性较强，对细胞代谢有较大的影响，使用后对实验干扰严重［8］。

草酸钾、肝素钠、柠檬酸钠的变化曲线与空白对照血样的变化曲线的形状很接近，但变化比较缓和，说明其对抑制血样的变质作用比较温和，且没有改变血液腐败的历程，仅仅让腐败的过程有所减缓。

综上所述，甲醛和亚硝酸钠在血液的防腐方面是最不适宜的，会对血样造成明显的破坏；草酸钾、肝素钠、柠檬酸钠均为较缓和的防腐剂，对血液中的蛋白不会造成明显的影响；氟化钠及其含氟化钠的混合物对抑制蛋白质的变质有明显的作用，但对某些酶可能有较强的破坏作用［9］。

［1］ 马晓璇，李汶.防腐剂的定量测定方法概况［J］.今日药学，2008，18（2）：24-28.

［2］ 李义龙，单战海，韩冰,等.酶法糖化血红蛋白试剂盒方法学比对评价［J］.中国实验诊断学，2010，14（8）：1336-1338.

［3］ 张高勤，张大明，宋朝锦,等.血液样品中防腐剂对碳氧血红蛋白稳定性的影响［J］.中国法医学杂志，2010，25（1）：20-23.

［4］ 陈洁，李润琪.环保型一氧化碳气体发生装置［J］.分析仪器，2006，(1)：58-59.

［5］ 汤其宁，郝敬贡，夏青.甲醛染毒对大鼠子代脏器及血液细胞的 影响［J］.环境与职业医学，2006，23（1）：56-58.

［6］ 沈高山，谷怀民，闫天秀,等.亚硝酸钠和氧合血红蛋白反应的拉曼光谱［J］.中国激光，2008，35（9）：1432-1436.

［7］ 雷霆雯，吴青青.氟化钠对小鼠肝脏细胞色素P4501A1酶活性的影响［J］.贵阳医学院学报，2010，35（4）：355-357.