骨碎补药材HPLC指纹图谱与鉴别

朱国婵 李建明 邱连建 曾斌

骨碎补(Rhizoma Drynariae)名贵中药材，是我院中药制剂常用的中药材，市售骨碎补药材有12种之多［1］。本实验研究以抽皮苷和新北美圣草苷为对照品，对10批不同产地的骨碎补药材进行测定，初步建立了HPLC指纹图谱，并进行方法学的考察，标出8个共有指纹峰，借此指纹图谱鉴定市售骨碎补药材的真假。

1 仪器与试药

2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。柚皮苷对照品(批号:110722-201002，中国药品生物制品检定所，供含量测定用。)新北美圣草苷(沈阳药科大学药学院提供纯度98%以上)。甲醇为色谱纯、乙醇、磷酸分析纯，实验用水(双蒸水)。10批骨碎补药材正品分别购自全国各地(见表1)，经广州中医药大学中药学院张丹雁教授鉴定。另外，广州市清平街市购买五个不同产地的骨碎补药材作鉴别。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备 分别精密称取干燥抽皮苷对照品和新北美圣草苷对照品5 mg和15 mg，分别置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，即得。精密称取骨碎补药材干粉1.0 g，置园底烧瓶加甲醇40 ml，热回流3 h，冷却后用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液置50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱:Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)-0.1% 磷酸水(B)，二元梯度洗脱，洗脱程序:A:0 min 0%，5 min 5%，30 min 30%，45 min 50%，55 min 60%，70 min 50%;柱温 28℃，流速:1 ml/min，检测波长为283 nm。在此色谱条件下骨碎补的各色谱峰能较好分离，见图1。

图1 骨碎补HPLC指纹图谱

2.3 样品中主成分含量的测定

2.3.1 标准曲线绘制 分别精密吸取抽皮苷和新北美圣草苷对照品溶液 0.50、2.5、5.0、10、20、30 μl进样，按 2.2 色谱条件测定各自峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各自标准曲线。结果:得回归方程:Y抽=789.66 X抽+1234.09，γ 抽 ＞0.9988;Y 新 =665.33 X 新 +2244.16，γ 新＞0.9966。抽皮苷在0.05～3.00μg，新北美圣草苷在0.15～9.00μg进样量与峰面积均呈良好的线性关系。

2.3.2 样品含量测定 精密吸取上述对照品溶液和上述10批样品的供试品溶液各10 μl，分别按照2.2色谱条件测定其各自峰面积，按2.3.1标准曲线计算，即得。详见表1。

表1 10批不同来源骨碎补药材中抽皮苷及主要成分含量测定结果

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取上述产地骨碎补中同一份供试品溶液连续进样6次，每次10ul，结果各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，相似度＞0.9978，RSD＜1.8%，表明使用仪器精密度良好。

2.4.2 重现性试验 取上述产地骨碎补中某一样品药材5份，分别制备供试品溶液，分别依法测定，结果各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，相似度＞0.9566，RSD＜2.0%，表明方法的重现性良好。

2.4.3 稳定性试验 取上述某一供试品溶液，分别在制备后0、6、12、24、48 h进样测定，结果指纹峰的相对保留时间和相对峰面积亦基本一致，相似度＞0.9788，RSD＜2.0%，表明样品溶液在48 h内稳定。

2.5 HPLC指纹图谱的构建

2.5.1 共有指纹峰的标定 按照文献［2］规定，以抽皮苷为参照物(S1)将各色谱峰保留时间与S1的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算，经过对照比较，其中8个色谱峰为槲蕨共有，相对保留时间为:，峰1(0.5287)，峰2(0.5411)，峰 3(0.6199)，峰 4(0.7455)，峰 5(0.8506)，峰6(0.9108)，峰7(1.0000)，峰 8(1.06891)为新北美圣草苷为参照物(S2)。因此标定它们为共有指纹峰见图2和图1。

图2 10批骨碎补药材的HPLC指纹图谱

2.5.2 共有指纹峰的相对峰面积 根据参考文献［2］和《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》把所有的峰面积全部标定并计算，各共有峰的相对峰面积依次为0.2729(1)、0.2144(2)、0.0209(3)、0.0398(4)、0.0158(5)、0.0188(6)、1.0000(S1)、0.9768(8)。(即 S2 新北美圣草苷)。其中 1、2、8 的峰面积均超过7号峰(抽皮苷峰)的10%。详见图1。这就作为定性鉴别骨碎补的依据。

2.6 广州外买五批骨碎补药材的鉴别 分别取五批外买供试品细粉各1.0 g，精密称定，按“2.1”条制备供试品溶液，在“2.2”色谱条件下测定其指纹图谱，见图3。

图3 五个不同来源骨碎补的HPLC指纹图谱比较

3 讨论

本文建立了骨碎补中药材HPLC指纹图谱，与文献［1，3］报导用几种不同色谱条件建立的指纹图谱相比，共有指纹峰均为8个，反映的化学成分信息相当。经对照品比较，确定7号峰为抽皮苷(S1)、8 号峰为新北美圣草苷(S2)，1、2、3、4、5、6均为骨碎补药材的有效化学成分。本文把它当作骨碎补药材指纹图谱的共有模式(图2)，并把它作为定性定量检测鉴定骨碎补药材的真假，评价其外在内在质量的依据。

广州市清平街市购买的五批骨碎补药材，经本骨碎补药材的HPLC指纹图谱(图2)比较鉴别，其中四批为非正品，因为共有指纹峰数不符，A、B、C各指纹峰的相对保留时间和峰面积无法匹配，更无法评价其相似度，其中D产品9个共有指纹峰中有7个可匹配，但其各峰相似度均小于0.7，所以为非正品。E产品8个共有指纹峰的相对保留时间和峰面积与(图2)可以匹配，其相似度大于0.9。而且抽皮苷含量0.74%，新北美圣草苷含量0.55%，即其主成分含量1.29%，在指纹图谱共有模式的测定范围之内。被认定为骨碎补正品。这比上世纪末骨碎补类生药商品调查使用的性状鉴定或显微鉴定研究方法先进、科学、准确、快速。与熊明玲［4］报导一致，但色谱条件不同其指纹图谱各异。

［1］刘惠平，刘曼，李超，李发美.骨碎补药材的高效液相指纹图谱.沈阳药科大学报，2008，25(2):133-136.

［2］ 蔡宝昌，刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术.北京，化学工业出版社，2005:22-25.

［3］李顺祥，张志光，龙勉，等.骨碎补超微饮片的HPLC指纹图谱研究.中草药，2005，36(11):1634-1637.

［4］熊明玲，刘凯南，高厚明，刘纪青.骨碎补高效液相指纹图谱的构建与应用.中国药业，2011，20(5):4-6.