黄芩苷对UVB诱导人皮肤成纤维细胞光产物生成的干预作用

吴迪，周炳荣，骆丹

（南京医科大学第一附属医院，南京 210029）

黄芩苷对UVB诱导人皮肤成纤维细胞光产物生成的干预作用

吴迪，周炳荣，骆丹

（南京医科大学第一附属医院，南京 210029）

目的 观察中波紫外线（UVB）诱导人皮肤成纤维细胞光产物的形成情况，以及黄芩苷的干预作用。方法 将各种不同浓度的黄芩苷（0～250μg/mL）与人皮肤成纤维细胞共同孵育24h后，采用免疫组织化学法及免疫斑点印迹技术检测30mJ/cm2UVB辐射及黄芩苷干预下，辐射后30min人皮肤成纤维细胞DNA内环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的产生情况。并采用紫外分光光度计法检测黄芩苷在紫外波段的吸光度。结果 黄芩苷能在UVB辐射后30min内减轻光产物的形成，其在UVA、UVB和UVC波段内有较强的吸收紫外线能量的能力。结论 黄芩苷对UVB诱导人皮肤成纤维细胞光产物的形成有一定抑制作用。黄芩苷是一种有效的紫外线防护剂。

黄芩苷；环丁烷嘧啶二聚体；中波紫外线

日光中的中波紫外线（UVB）可以诱发红斑和日晒伤，并与皮肤癌有关。UVB照射常可以导致细胞DNA损伤，特别是光加合物环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimmers,CPDs）的生成，如果修复不完善，即可导致DNA突变及皮肤癌的发生[1-5]。生物体有固有的切除和修复光产物的能力，这些生理性修复活动同时会受到外界因素，如药物的影响。一些实验已经证实黄芩苷具有广泛的生物学效应，如在我们既往的研究中发现，黄芩苷能拮抗UVB辐射所致的皮肤细胞因子分泌变化和光产物的清除[6-9]，但黄芩苷是否对经过UVB辐射后的人皮肤成纤维细胞的光产物的形成有干预作用，尚未见报道。本实验主要研究UVB照射后CPDs的生成情况以及黄芩苷对UVB辐射人皮肤成纤维细胞CPDs生成的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 黄芩苷（中国生物制品鉴定所）使用培养基配成浓度为10mg/mL的溶液备用；紫外线辐射仪（上海Sigma公司，并以配套的探测仪测定UVB剂量）；紫外-可见光谱仪（日本岛津UV-2450）；CPDs一抗（美国Sigma生物科技公司）；免疫组化试剂盒 (博士德生物工程有限公司)；AEC显色试剂盒（迈新生物科技公司）；全基因组DNA提取试剂盒（碧云天生物科技公司）。

1.2 人皮肤成纤维细胞与细胞爬片 原代培养人皮肤成纤维细胞，取8～12代细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为5×105/mL，以每孔106个细胞接种于含无菌盖玻片的6孔板，细胞90%融合时辐射UVB。

1.3 实验分组及处理 将人皮肤成纤维细胞分为对照组、UVB辐射组和UVB＋黄芩苷组。对照组细胞分别为未经处理和经250μg/mL黄芩苷处理组；UVB辐射组细胞经过30mJ/cm2UVB辐射；UVB＋黄芩苷组细胞分别经过 50、100、150、200、250μg/mL处理24h后接受30mJ/cm2UVB辐射。各组辐射组细胞在辐射后30min进行如下检测。

1.4 免疫组织化学法检测CPDs 将细胞爬片用10%中性缓冲福尔马林固定4h以上，封闭非特异性抗原后，滴加用PBS适当稀释的一抗（小鼠抗人CPDs IgG单抗稀释1 000倍），37℃孵育1h后，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min后滴加试剂SABC，37℃孵育20min后以AEC显色：使用AEC显色试剂盒室温显色后显微镜观察。细胞核中有红色颗粒者为CPDs阳性细胞。

1.5 免疫斑点印迹法检测CPDs 按照全基因组DNA提取试剂盒说明书，按一般步骤提取细胞DNA，将之使用加样器点于带正电的硝酸纤维素膜上，封闭非特异性抗原后，用PBS适当稀释的一抗（小鼠抗人CPDs IgG单抗稀释1 000倍）37℃孵育1h后，加入生物素标记的羊抗鼠IgG(稀释1 000倍)37℃孵育1h后，经相应底物显色后，凝胶成像扫描系统处理后进行数据分析。

1.6 紫外-可见光谱测定 参照文献[10]。取0.1mg黄芩苷溶于10mL甲醇，调节溶液浓度，使200～500nm之间的最大吸收峰的吸光度A值在0.1～O.5之间。取制备的样品2～3mL，在200～500nm范围内进行紫外-可见光谱测定。

1.7 数据处理 采用单因素方差分析，组间比较用LSD法，数据用±s表示，数据处理应用SPSS for Windows11.0统计软件。

2 实验结果

2.1 黄芩苷对UVB辐射后人皮肤成纤维细胞光产物影响的形态学变化 在未处理组，人皮肤成纤维细胞无明显阳性细胞核；阳性细胞只出现在经过UVB辐射组中，在UVB辐射组中阳性细胞的数量和强度明显多于UVB＋黄芩苷组。见图1～3。

2.2 不同浓度的黄芩苷对UVB辐射后人皮肤成纤维细胞光产物生成的影响 如图4所示，在对照组无CPDs阳性信号；仅在经过UVB辐射的细胞中出现CPDs阳性信号；以UVB辐射组平均信号强度为100%计算，在UVB＋黄芩苷组中，经过浓度为50、100、150、200、250μg/mL 的黄芩苷的处理的细胞的CPDs的信号强度分别为（98.23±6.25）%、（93.44±5.12）%、（78.19±7.35）%、（45.45±6.32）%和（21.14±9.03）%。与UVB组相比，当黄芩苷的浓度大于150μg/mL时，信号强度差异有统计学差异（P<0.05）。

2.3 黄芩苷的紫外-可见光谱 如图5中所示，黄芩苷的甲醇溶液紫外光谱在200～400nm区域内出现了4个强吸收峰，吸收波长分别为204nm、214.80nm、277.20nm和316.6nm。强吸收峰分别分布于UVA、UVB和UVC波长范围内。

3 讨论

日光中的紫外线辐射（UVR）是引起皮肤炎症、日晒伤、日光性皮肤病、光老化及皮肤癌的主要环境因素[1，2]。其中UVB的生物学效应强度是UVA的800～1 000倍，是引起皮肤急慢性损害和光致癌的最重要波段。在光致癌过程中细胞DNA是紫外线的主要靶分子，UVB辐射可引起多种DNA损伤，其中最主要的是形成特征性光产物环丁烷嘧啶二聚体CPDs和6-4PPs[3]。一般认为CPDs比6-4PPs更致癌，形成的量是其3倍且修复效率也低于后者。两种损伤都能导致基因突变如C→T或CC→TT转换，即紫外线诱导的突变。CPDs被认为是UVB诱导皮肤癌的重要介质[4，5]。

中药黄芩含有丰富的黄酮类化合物，其中主要活性成分是黄芩苷，黄芩苷具有广泛的药理作用。黄芩苷对UV有很强的吸收能力，吸收范围广，是无毒、无害、优良的天然紫外线吸收剂[11]。现代药理实验证实黄芩苷有抗变态、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、清除自由基等药理作用[12-15]。本研究小组的一些实验结果也已经证实黄芩苷能拮抗UVB辐射所致的成纤维细胞和角质细胞突变增加和光产物的清除[6-9]。为本实验的开展提供了先期基础和依据。

本实验采用免疫组织化学法和免疫斑点印迹法检测UVB辐射及黄芩苷处理后对人皮肤成纤维细胞CPDs的产生情况。免疫组化结果显示：非照光组未见阳性细胞，即无CPDs形成；各个UVB辐射组有CPDs产生及细胞DNA损伤，可检测到阳性细胞（见图1～3）。一般认为在UVB辐射后细胞在即时开始产生CPDs，30min内达到高峰，在本实验中我们从免疫斑点印迹法结果中观察到UVB+黄芩苷实验组中，当黄芩苷的浓度大于150μg/mL时CPDs的表达强度明显降低。笔者认为此结果证实了黄芩苷的光保护作用，尤其对人皮肤细胞的DNA有明显的保护作用，此外从图3中我们也可以看到黄芩苷可以在各个紫外波段内出现吸收峰值，并且在UVB波长范围中有较强的UV吸收能力，由此可以部分解释黄芩苷减少CPDs产生的原因。但结合本研究小组既往的研究成果，还不能据此就认为黄芩苷在光保护作用中发挥的仅是紫外线吸收剂的作用，因为我们发现在外用黄芩苷的野生型小鼠皮肤受到UVB辐射后，其CPDs的产生受到抑制，但清除过程也大大加快[9]；此外，茶多酚单体（EGCG）和黄芩苷一样属于黄酮类抗氧化剂，在既往研究中也发现有光保护作用[16]，但在黑素细胞经过200μg/mL EGCG处理24h后接受UVB辐射，其CPDs的生成却没有明显改变[17]。我们推测黄芩苷抑制光产物形成的作用还与之其他一些特性相关。

总之，在本实验中我们发现，黄芩苷对UVB诱导光产物的形成有防护作用，由此提示黄芩苷可能是一种有效的紫外线防护剂，但其作用的具体机制仍需要进一步研究。

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Inhibitory Effects of Baicalin on Formation of the Photoproduct in Human Skin Fibroblasts Induced by Ultraviolet B Light

WU Di,ZHOU Bing-rong,LUO Dan
First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Baicalin on formation of the photoproduct in human skin fibroblasts induced by ultraviolet B （UVB） light.MethodsHuman skin fibroblasts were incubated with various concentrations of Baicalin (0-250μg/mL)for 24 hours.Immunohistochemistry and immune dot blot test(IDBT)was used to detect cyclobutane pyrimidine dimmers(CPDs)in DNA of human skin fibroblasts 30 minutes after 30mJ/cm2UVB radiation and Baicalin intervention.The UV absorbance ability of Baicalin was detected by UV spectrophotometer.ResultsBaicalin could reduced CPDs formation 30 minutes after UVB radiation.Baicalin had a strong ability to absorb ultraviolet energy within UVA,UVB and UVC band.ConclusionBaicalin can inhibit the the formation of the photoproducts induced by UVB light in human skin fibroblasts.Baicalin is an effective UV protectant.

Baicalin;cyclobutane pyrimidine dimers;ultraviolet B

R285

A

1672－0709（2011）05-0273－03

国家自然科学基金项目(30771946及81000700)

骆丹，E-mail:daniluo2005@yahoo.com.cn

2011-05-15)