罗格列酮对HUVECs受损的保护作用及对TNF-a和IL-6水平的影响

李 倩， 焦 燕， 彭 海

Gokkusu等研究表明同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可以促炎症介质释放增加，导致内皮细胞损伤［1～3］，而后者是动脉粥样硬化的始动因素［4］。PPARs属于Ⅱ型核受体配体依赖转录因子超家族成员。近年的研究显示，在特定配体激活下，PPARs可以抑制炎性因子表达和炎症反应［5～7］。罗格列酮(Rosiglitazone，Ros)是PPARγ高亲和力的配体，有调节炎症反应的作用。本研究旨在观察罗格列酮是否对Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤有保护作用以及对TNF-a和IL-6水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Hcy(Sigma公司);罗格列酮(浙江万马公司);兔抗人Bax抗体、兔抗人Bcl-2抗体及兔抗人Caspase-3抗体(武汉博士德);兔抗人PPARγ抗体(Cell Signing Technology);兔抗人β-actin和辣根酶标记鼠抗兔二抗(武汉博士德);TNF-α和IL-6试剂盒(武汉博士德)。

1.2 细胞培养 脐带取自华中科技大学附属协和医院产科健康产妇。PBS冲洗静脉腔，0.25%胰蛋白酶(trypsin)灌注消化(37℃，10min)，血清灭活，离心收集细胞团，转移至铺有0.2%明胶的T25培养瓶中，置于37℃，含5%体积分数CO2培养箱中培养。HUVECs培养液为含20%胎牛血清的DMEM培养基，细胞融合90%以上时用0.25g/L胰酶消化传代，第2～3代用做实验。

1.3 细胞分组及处理 HUVECs分为对照组(A组，DMEM培养基);实验组(B组，Hcy 100μmol/L);干预组(C组，Ros)，再根据不同浓度分为(C1:Hcy 100μmol/L+Ros10nmol/L)，(C2组:Hcy 100μmol/L+Ros 20nmol/L)(C3 组:Hcy 100μmol/L+Ros 30nmol/L)，各培养24h和48h。

1.4 MTT实验 HUVECs按每孔2×103个/ml的密度接种于96孔板中，每组5个复孔，试验重复3次。细胞贴壁后按实验分组加入试剂，48h后每孔避光加入5mg/ml MTT 50u L，混合均匀后置于37℃，含5%体积分数CO2，培养箱孵育4h后吸取上清液，每孔加入 DMSO 200μl，振荡10min。采用酶标仪测定各孔吸光度值(波长570nm处)。

1.5 免疫细胞化学法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达 取对数生长期HUVECs，按1×106/ml的密度接种于含有盖玻片的6孔板内进行爬片，待细胞长至盖玻片50%的时候，改换成用无血清的培养基继续培养24h，细胞饥饿24h，使细胞同步化于G0期。然后每组分别加入相应的试剂，继续培养分别至24及48h，用4%多聚甲醛固定，行Bax、Bcl-2、Caspase-3的免疫细胞化学染色，染色步骤严格按SABC、DAB试剂盒说明书操作。

1.6 ELISA法检测上清液TNF-α和IL-6水平

分别采用TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒测定，严格按试剂盒和酶标仪说明操作。在酶标仪上测定λ=450nm的TNF-α和IL-6的吸光度值，根据标准品的不同浓度绘制标准曲线，计算细胞培养上清液的TNF-α和IL-6水平。

1.7 Western-blot检测 PPARγ蛋白表达 取各组细胞约1×106/L，加入电泳裂解缓冲液，取20μg变性裂解蛋白进行SDS-PAGE膜电泳，然后电转移至PVDF膜，脱脂牛奶封闭后，将膜置2ml稀释好的抗PPARγ一抗体液(1∶200)，4℃ 孵育过夜，TBST液摇洗4次，每次5min。然后将膜置10ml含辣根过氧化酶HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2000)室温下孵育2h，再用ECL试剂盒进行发光、显影、定影，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度。

1.8 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料均采用±s，资料采用t检验或LSD法进行组间两两均数比较，以P＜0.05为显著性差异标准。

2 结果

2.1 检测细胞存活率 罗格列酮对100μmol/L Hcy所致的细胞损伤具有明显的保护作用。随罗格列酮浓度增加和作用时间延长，细胞存活率增加(P ＜0.05，见表1)。

2.2 免疫细胞化学分析 与Hcy组相比，罗格列酮组Caspase-3，Bax蛋白表达明显下降，Bcl-2表达明显增高，呈浓度和时间依赖性(P＜0.05，见表2)。

2.3 炎症介质TNF-α和IL-6水平变化 Hcy使HUVECs产生炎症介质，随着Hcy作用时间延长，TNF-α和IL-6水平增高。罗格列酮明显降低TNF-α和IL-6水平，且具有时间及浓度依赖性(P＜0.05，见表3)。

2.4 PPARγ蛋白表达检测 与Hcy组比较，Ros干预组(C组)PPARγ表达明显上调，呈浓度和时间依赖性(P ＜0.05，见图1)。

表1 罗格列酮对HUVECs存活的影响±s)

表1 罗格列酮对HUVECs存活的影响±s)

与B组相比*P＜0.05;与C1相比 #P＜0.05;与C2相比△P＜0.05;与24h相比▲P ＜0.05

组别细胞存活率(%)24h 48h A组B组C1组C2组C3组91.78 ±0.0121.34 ±0.0228.76 ±0.02*39.22 ±0.02*#52.46 ±0.01*#△91.44 ±0.0113.58 ±0.0141.22 ±0.01＊▲54.84 ±0.01*#▲63.36 ±0.01*#△▲

表2 罗格列酮对Bax、Bcl-2、Caspas-3蛋白表达的影响(%±s)

表2 罗格列酮对Bax、Bcl-2、Caspas-3蛋白表达的影响(%±s)

与B组24h相比*P＜0.05;与B组48h相比#P＜0.05;与24h相比△P＜0.05

组别Caspase Bax Bcl-2 24h 48h 24h 48h 24h 48h B C1 C3 34.63 ±1.bl_4.34 ±0.22*22.45 ±1.04*46.39 ±3.33△23.73 ±1.01#△17.97 ±0.40#△54.23 ±2.0547.09 ±1.74*41.59 ±1.11*78.58 ±3.71△45.17 ±1.35#△43.12 ±1.58#△46.004 ±1.5150.16 ±1.45*52.10 ±4.17*44.76 ±0.62△63.67 ±2.69#△76.26 ±7.39#△

表3 罗格列酮对IL-6和TNF-a表达的影响(pg/ml±s)

表3 罗格列酮对IL-6和TNF-a表达的影响(pg/ml±s)

与A 组相比*P ＜0.05;与 B 组相比#P ＜0.05;与24h相比△P ＜0.05

IL-6 TNF-a 24h 48h 24h 48h ABC 1 C2 C3 163.67 ±3.le475.00 ±5.29*227.33 ±2.52#217.00 ±5.57#200.00 ±3.61#165.00 ±4.00276.67 ±6.11＊△223.67 ± 4.51#△188.00 ± 2.65#△174.00 ± 2.65#△1.35 ±0.012.62 ±0.01*2.22 ±0.01#2.09 ±0.04#1.93 ±0.08#1.35 ±0.013.58 ±0.02＊△2.17 ±0.01#△1.71 ±0.01#△1.56 ±0.02#△

图1 ROS不同浓度及时间对PPARγ蛋白表达的影响

3 讨论

1999年Ross提出动脉粥样硬化(AS)是动脉壁的一种慢性炎症反应过程，细胞因子在涉及AS各阶段的炎症反应事件中发挥重要的调节作用。Tomlinson等［8］研究发现，Hcy是一种炎症刺激物，它可以刺激内皮细胞产生多种炎性因子如TNF-α和IL-6损伤内皮细胞，导致血管炎性损伤。TNF-α是一种致炎性细胞因子，生物活性广泛而强烈，不仅参与炎症反应过程，而且还与其它炎性因子组成复杂的网络系统，通过相互诱生而互相影响生物学效应，使机体出现多种病理损害。TNF-α还可作为配体作用于内皮细胞表面的死亡受体(如TNFR1)，进而传递信息进入细胞内引发凋亡［9，10］。IL-6又称B细胞刺激因子2，动脉粥样硬化病灶的主要细胞如内皮细胞、血管平滑肌细胞等都能分泌［11］。IL-6也是有广泛生物活性的细胞因子，是炎症反应的敏感标记物，也是机体复杂的细胞因子网络中重要成员之一，参与多种疾病的炎症病理过程，通过细胞信号转导激活核转录因子-кB(NF-кB)，使炎症介质和细胞因子的基因转录增强，进一步促使中膜的平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖并发生表型转化，还导致更多的炎症介质释放，促使更多的单核细胞聚集、浸润，导致动脉粥样硬化病变的发生发展。本研究发现，相对于对照组，Hcy组细胞培养液中TNF-α和IL-6水平明显增高，并且细胞存活率下降，促凋亡的蛋白表达增加，抗凋亡蛋白表达下降，证实Hcy是炎症反应的刺激物，可以诱导HUVECs合成和分泌TNF-α和IL-6，致使HUVECs受损。

PPARs属于Ⅱ型核受体配体依赖转录因子超家族成员，其亚型PPARγ在参与动脉粥样硬化斑块形成和演变过程中的内皮细胞、平滑肌细胞等及动脉粥样硬化病灶组织中均有较为广泛表达。最近的研究表明，PPAR也可能参与炎症调控，如抑制TNF-α，IL-6等表达。大多数研究表明PPARγ激活剂有抗炎作用［12，13］。罗格列酮是一种 PPARγ的人工合成配体激动剂噻唑烷二酮类(TZD)降糖药。Zhou等在基因敲除小鼠实验中发现罗格列酮可通过调控血管内皮炎症，在增强动脉粥样硬化斑块稳定性等方面发挥抗 AS作用［14］。本实验建立 Hcy诱导的 HUVECs损伤模型，用不同浓度罗格列酮进行干预。结果显示与Hcy组相比，罗格列酮可提高细胞的存活率;降低TNF-α和IL-6水平，呈浓度和时间依赖性;还可下调Bax和Caspase-3蛋白表达，上调Bcl-2和PPARγ蛋白表达。说明罗格列酮对Hcy诱导HUVECs产生的TNF-α和IL-6均有抑制作用。

实验结果显示罗格列酮可保护Hcy损伤的HUVECs，其作用可能是通过降低炎症细胞因子TNF-a和IL-6的水平，调节Bax和Bcl-2蛋白水平而实现。研究为罗格列酮降低炎性因子TNF-α和IL-6的水平，防治动脉粥样硬化及相关疾病提供了实验依据。

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