缬沙坦对大鼠粥样硬化动脉血管组织MCP-1及AT1R蛋白表达的影响

王庆丽，赵慧颖，马小欣

（1.吉林大学第一医院 心血管中心，吉林 长春 130021；2.宁波市医疗中心李惠利医院，浙江 宁波 315000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是多种病因及易患因素共同作用的结果，慢性炎症在AS的形成及发展中具有重要作用。单核/巨噬细胞、淋巴细胞是参与AS的主要炎症细胞，而巨噬细胞来源于循环中的单核细胞，单核细胞进入血管壁是AS发生的关键步骤。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是诱导单核细胞迁移的诱导剂，参与泡沫细胞形成及AS的发生、发展全过程。近年研究发现肾素-血管紧张素 -醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）参与AS的发病，且MCP-1蛋白的表达与RAAS系统的激活密切相关，但具体机制尚不完全清楚。本研究通过构建大鼠动脉粥样硬化模型，采用免疫组化半定量分析法研究斑块中AT1R和MCP-1蛋白表达的关系，探讨血管紧张素受体阻断剂-缬沙坦的抗动脉粥样硬化作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠，体重在220～250 g，购自吉林大学实验动物中心。

1.2 药物及试剂

缬沙坦（代文）为北京诺华制药有限公司赠与，胆固醇、胆酸钠购自湖南祁东县同信生化厂，丙基硫氧嘧啶购自上海复星朝晖药业有限公司，维生素D3粉购自北京华明盛商贸发展有限公司，兔抗鼠MCP-1一抗、AT1R一抗购于广州市宝泰克生物科技有限公司，SP试剂盒和液体DAB酶底物显色试剂盒购于广州市宝泰克生物科技有限公司，抗原修复液、防脱片、消化液等购于福州迈新生物技术有限公司。

1.3 动物分组

将30只健康雄性Wistar大鼠（体重220～250 g），随机分为以下3组：①正常对照组（10只），②动脉硬化组（10只），③缬沙坦组（10只）。正常对照组行假球囊损伤手术给予正常饮食；余2组每只大鼠给予30万u/kg体重维生素D3右下肢肌肉注射后用球囊行动脉拉伤，在基础饲料中加入2%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、维生素D3粉剂（1.25×106u/kg饲料）、3%猪油等饲养。缬沙坦组同时给予缬沙坦30 mg/kg体重，1次/d次灌胃。喂养9周后空腹24 h抽血并处死，检测血脂水平，自主动脉弓下约1.0 cm处留取动脉组织1.0 cm用4%甲醛溶液固定，行HE染色及免疫组化分析。球囊拉伤过程如下[1]：戊巴比妥钠30 mg/kg体重腹腔麻醉后，常规消毒，于胸骨上约1 cm处切开左侧颈部皮肤，分离左颈总动脉，结扎远心端，近心端用手术线拉起阻断血流，滴硝酸甘油数滴于颈总动脉上，切开动脉前壁约1.0 mm小口，将内径为1.5 mm，长20.0 mm球囊向近心端插入，进入约8.0 cm，球囊内注入0.2 mL生理盐水，来回拉动3、4次，放水再进约8.0 cm，注水、回拉，共3次。拔出球囊，结扎近心端。消毒、缝合皮下组织、皮肤。假球囊损伤手术为切开左侧颈部皮肤，分离左侧颈总动脉，结扎远心端和近心端，剪断动脉，但不插球囊管。

1.4 血脂检测

9周末大鼠空腹24 h后，戊巴比妥钠30 mg/kg体重腹腔麻醉后，在肾动脉分叉处取血，离心（3 000 r/min，15 min），取血清1.0mm采用全自动生化分析仪（XL20）检测总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）。在吉林大学第一临床医院生化科完成。

1.5 动脉组织H-E染色及免疫组化染色

9周后处死动物，取主动脉全段，生理盐水冲洗后观察，自主动脉弓下约1.0 cm处留取动脉组织用4%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋后切片，行HE及免疫组化染色。用高倍显微镜观察血管内膜和中膜的变化。免疫组化染色法取制备好的切片（厚度为5μm）分别加入抗血管紧张素Ⅱ-1型抗体（兔抗鼠多克隆抗体1∶150）、抗单核细胞趋化蛋白抗体（兔抗鼠多克隆抗体，1∶150），采用S-P法，DAB显色，脱水透明后中性树脂封固。正常对照组实验用PBS取代一抗，其余步骤同上，以上步骤严格按照试剂说明进行，棕黄色产物为阳性染色。采用CHA型双目光学显微摄影系统及Luzex-F图象分析软件进行图像分析，在图像分析系统上，每个切片随机取5个高倍视野，每个视野测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度，MCP-1蛋白质表达半定量的结果以阳性信号指数表示，取均值后计算抗原阳性信号指数。计算公式：阳性信号指数=信号面积×阳性信号平均灰度/测定面积×100，计算各自的阳性表达。AT1R在血管的阳性表达以面密度表示，同上述方法测5个视野，计算公式：面密度=目标总面积/统计场总面积。

1.6 统计学分析

所有数据采用SPSS11.5软件包进行分析。行方差分析，各组均数间用Student-Newman-Keuls法行两两比较，以（±s）表示，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 血脂水平变化

9周后动脉硬化组和缬沙坦组与正常对照组比较，TC、TG和LDL-C 明显升高（P＜0.01），HDL-C明显降低（P＜0.01），而动脉硬化组和缬沙坦组之间无明显差异（P＞0.05）。见表 1。

2.2 各组动脉组织病理形态学检测

正常对照组肉眼可见内膜光滑，无斑块形成；动脉硬化组血管内膜表面粗糙，凹凸不平，大量黄白色斑块突出于管腔表面，并连接成片，以近主动脉弓处及血管开口处最为明显，有的部位呈同心性环状。缬沙坦组可见散在的白色斑块突出于管腔表面，主要集中在血管开口处，较少连接成片。HE染色可见正常对照组血管分层清晰，内膜完整，内皮连续，中层平滑肌细胞排列正常无增生，外层为疏松结缔组织；动脉硬化组可见明显的动脉粥样硬化斑块形成，动脉内膜呈偏心性增厚，斑块内充满泡沫细胞，内膜有少量炎细胞及增生的平滑肌细胞，中层平滑肌细胞明显增生，伴有点状和片状钙化；缬沙坦组与动脉硬化组比较，血管内膜、中膜平滑肌细胞增生均明显减轻，内膜和中膜的分层较清晰，平滑肌细胞与正常对照组比较排列紊乱，其间可见少量散在的脂质沉积和泡沫细胞。见图1。

表1 实验9周后各组血脂变化情况 （mmol/L，±s）

表1 实验9周后各组血脂变化情况 （mmol/L，±s）

注：动脉硬化组和缬沙坦组较正常对照组相比，血脂明显升高（†P＜0.01）；正常对照组：正常饮食；动脉硬化组：高脂饮食；缬沙坦组：高脂饮食，并给予缬沙坦饮食.

组别 TG TC LDL-C HDL-C正常对照组 0.39±0.07† 2.74±0.48† 1.93±0.31† 1.75±0.26†动脉硬化组 0.81±0.14 7.14±0.76 6.22±0.18 0.80±0.33缬沙坦组 0.83±0.11 7.05±0.71 6.24±0.29 0.79±0.27

2.3 各组大鼠主动脉内膜、中膜AT1R的阳性表达及半定量分析

图1 各研究组大鼠胸主动脉的HE染色结果

图2 各研究组大鼠胸主动脉的AT1R免疫组化染色结果

正常对照组血管内膜、中膜均未见明显的AT1R阳性表达；动脉硬化组的内皮细胞和平滑肌细胞AT1R表达均明显增多呈深褐色，部分呈点状、片状着色；缬沙坦组偶见内皮细胞有AT1R表达（见图2）。AT1R的阳性表达用面密度表示：动脉硬化组与法缬沙坦组、正常对照组比较，动脉内膜及中膜AT1R表达明显升高（P＜0.001）；缬沙坦组与正常对照组比较，AT1R的表达亦有升高，但两组间比较无明显差异（P＞0.05）。

2.4 大鼠主动脉内膜、中膜MCP-1蛋白的阳性表达及半定量分析

正常对照组未见明显MCP-1蛋白阳性表达；动脉硬化组的内皮细胞和平滑肌细胞胞浆中可见大量MCP-1蛋白阳性表达，为深褐色，呈点状或片状着色；缬沙坦组的内皮细胞和平滑肌细胞胞浆中可见少量MCP-1蛋白阳性表达。见图3。MCP-1蛋白的阳性表达用阳性信号指数表示：动脉硬化组与缬沙坦组、正常对照组比较，动脉内膜、中膜MCP-1蛋白表达均明显升高（P＜0.001）；而缬沙坦组仍高于正常对照组（P＜0.05）。各实验组动脉组织中AT1R和MCP-1蛋白表达的半定量分析比较。见表2。

表2 实验9周后各组血管组织中AT1R和MCP-1蛋白的阳性表达情况

图3 各研究组大鼠胸主动脉的MCP-1免疫组化染色结果

3 讨论

AS是多种病因及易患因素共同作用的结果，最近有人提出了动脉粥样硬化是一种长期的慢性炎症性病理过程，斑块的形成涉及脂类代谢障碍、血管内皮细胞功能异常、巨噬细胞浸润、血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集等多种因素。大量研究已经表明，RAAS参与了AS的病理过程，AngⅡ可与细胞膜结合促进低密度脂蛋白的氧化及摄取、影响内皮细胞功能[2-4]，目前临床中应用ACEI类和ARB类拮抗RAAS系统的药物来降低血压、改善心肌重构等降低临床的心血管事件。而对于ACEI和ARB类药物除降压、改善心肌重构外，对心血管系统的其它作用仍需进一步的研究。本实验采用免疫组化法检测在高脂饮食基础上形成AS时血管组织中AT1R和MCP-1蛋白表达的变化以及缬沙坦对二者表达的影响，探讨缬沙坦抗AS作用及可能机制。结果发现，在主动脉AS斑块中AT1R和MCP-1蛋白表达均明显升高，且AS斑块中AT1R和MCP-1蛋白表达呈正相关（r=0.635）；而缬沙坦组与动脉硬化组比较，AT1R的表达被明显抑制，二者有明显的差异（P＜0.001），缬沙坦组与正常对照组比较AT1R的表达也有所升高，但差异无统计学意义；缬沙坦组的MCP-1蛋白表达与动脉硬化组比较明显降低（P＜0.001），与正常对照组比较明显升高（P＜0.05）。这一结果表明RAAS系统的激活对AS的发生、发展有着直接影响，并且RAAS系统被激活后通过AT1R又增加了MCP-1蛋白表达，促进了AS的进展。而缬沙坦通过拮抗AT1R的表达抑制了MCP-1蛋白表达起到了抗AS的作用。

当血管壁发生AS病变时，血管壁上的AngⅡ产生会明显增多，资料表明：AngⅡ诱导AS病变的增强，是由AngⅡ直接作用于有AS病变的血管壁细胞，激活了炎症系统，引起IL-6、TNF等炎性介质释放增加和MCP-1、CCR2等化学增活素的基因表达增强，并且增加的AngⅡ的浓度和活性可以正反馈的增加AngⅡ的产生[5]。AT1R是RAAS系统激活后AngⅡ作用于血管壁导致AS发生、发展的必要受体，AT1R在AS时表达增多并通过促进MCP-1蛋白表达，促进了单核/巨噬细胞的聚集和内移参与了AS的形成过程，并且在中晚期可以促进平滑肌细胞移行和增殖参与了AS的进展[6]。也有文献报道AngⅡ促进AS与血管平滑肌细胞过早凋亡有关[7]。AT1R的激活在AS发病机制中可能与多种细胞因子的激活有关，在AT1R基因敲除鼠中可以抑制高脂饮食所致的血管氧化应激、内皮细胞功能异常和AS的形成；也可以抑制高胆固醇饮食引起的全身组织中血管紧张素原和血管紧张肽的增加[8-9]。AT1受体拮抗剂在家兔AS模型中通过抑制斑块中单核细胞的聚集和增加胶原纤维的沉积，可以起到增加斑块稳定性，减少斑块破裂的作用[10]。

本研究结果表明在AS斑块中AT1R和MCP-1蛋白表达均明显增加，给予缬沙坦干预的治疗组通过抑制AT1R的表达，抑制了血管组织中MCP-1蛋白的表达，起到了抗AS的作用，提示了缬沙坦通过抑制MCP-1蛋白的表达可以起到抗AS的作用。同时缬沙坦组MCP-1蛋白的表达仍高于正常对照组，说明高脂饮食及球囊损伤诱发的动脉粥样硬化还与RAAS系统激活、MCP-1蛋白表达增加以外的其他因素参与有关[11]。

[1]FONSECA FAH,PAIVA TB,SILVA EG,et al.Dietary manaesium improves endothelial dependent relaxation of ballon injured arteries in rats[J].Atheros-clerosis,1998,139:237-242.

[2]DAIJU FUKUDA,SOICHIRO ENOMOTO,YOICHIRO HIRATA,et al.The angiotensin receptor blocker,telmisartan,reduces and stabilizes atherosclerosis in ApoE and AT1aR double deficient mice [J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2010,64(10):712-717.

[3]PAN P,FU H,ZHANG L,et al.Angiotensin II upregulates the expression of placental growth factor in human vascular endothelial cells and smooth muscle cells[J].BMC Cell Biol,2010,11:36-44.

[4]赵慧颖,徐宝华,马小欣.兔动脉粥样硬化形成过程中血清NOS活性的变化[J].基础医学与临床,2007,27(9):1021-1024.

[4]ZHAO HY,XU BX,MA XX.Atherosclerosis in rabbits during the formation of NOS activity in serum[J].Basic and Clinical,2007,27(9):1021-1024.Chinese

[5]RUIZ-ORTEGA M,LORENZO O,RUPEREZ M,et al.Angiotensin II activates nuclear transcription factor kappaB through AT (1)and AT (2)in vascular smooth muscle cells:molecular mechanisms[J].Circ Res,2000,86(12):1266-1272.

[6]GAIA S,MINGYI W,ROBERT M,et al.Rat a ortic MCP-1 and its receptor CCR2 increase with age and alter vascular smooth muscle cell function[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:1397-1402.

[7]TAKESHIGE K,TOHRU M,JUN-ICHIRO N,et al.Angiotensin II induces premature senescence of vascular smooth muscle cells and accelerates the development of atherosclerosis via a p21-dependent pathway[J].Circulation,2006,114:953-960.

[8]SVEN W,THOMAS C,MARTIN VAN E,et al.Inhibition of diet-Induced atherosclerosis and endothelial dysfunction in apolipoprotein E/angiotensin II type 1a receptor double-knockout mice[J].Circulation,2004,110:3062-3067.

[9]ALAN D,DEBRA L,HONG L,et al.Hypercholesterolemia stimulates angiotensin peptide synthesis and contributes to atherosclerosis through the AT1A receptor[J].Circulation,2004,110:3849-3857.

[10]No authors listed.Inflammation and atherosclerosis:the role of Renin-Angiotensin system and its inhibition[J].Kardiiologiia,2010,50(10):50-59.

[11]LIU B,DHAWAN L,BLAXALL BC.et al.Protein kinase Cδ mediates MCP-1 mRNA stabilization in vascular smooth muscle cells[J].Mol Cell Biochem,2010,344:73-79.