血府逐瘀汤诱导内皮细胞迁*移中Ⅳ型胶原酶的作用研究

高 冬，陈文元，郑良朴，林 薇，吴立娅，宋 军，陈可冀

(1．福建中医药大学中西医结合学院，福州 350108);2．福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350108;3．中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;4．中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

血府逐瘀汤诱导内皮细胞迁*移中Ⅳ型胶原酶的作用研究

高 冬1，陈文元1，郑良朴2，林 薇2，吴立娅1，宋 军3△，陈可冀4

(1．福建中医药大学中西医结合学院，福州 350108);2．福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350108;3．中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;4．中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

目的:探讨血府逐瘀汤影响Ⅳ型胶原酶诱导内皮细胞迁移的作用。方法:运用血清药理学方法，以1．25%、2．5%和5%浓度的血府逐瘀汤含药血清和空白血清培养人脐静脉内皮细胞ECV304，采用Boyden小室迁移法检测药物对内皮细胞迁移的影响，并通过酶联免疫法和RT-PCR检测明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)分泌和表达的情况。结果:1．25%浓度含药血清对上述指标无影响，2．5%和5%浓度含药血清可显著提高内皮细胞迁移、MMP-2和MMP-9转录及细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9水平。结论:血府逐瘀汤通过提高Ⅳ型胶原酶的表达进而诱导内皮细胞迁移，提示药物促血管新生功能可能与该作用相关。

血府逐瘀汤;细胞迁移;MMP-2;MMP-29

血府逐瘀汤是临床常用的活血化瘀经典方，本项目组前期体内、体外实验，从内皮祖细胞和内皮细胞等不同角度、不同层面的系列工作均表明该方剂具有显著的促血管新生作用，为该方剂治疗缺血性疾病临床疗效提供了部分实验依据［1-6］，但药物促血管新生多途径、多靶点的复杂机制尚未阐明清晰。血管新生是在原有管腔基础上，由内皮细胞以出芽的方式扩增、迁移并相互联结形成血管内膜腔，进而成为新血管的过程。内皮细胞的迁移是血管新生的关键步骤［7］，而Ⅳ型胶原酶在细胞迁移中发挥重要作用，故本研究以内皮细胞ECV304为实验模型，探讨Ⅳ型胶原酶在血府逐瘀汤诱导内皮细胞迁移中的作用，为该方剂促血管新生的药效机制研究提供进一步的支撑材料。

1 材料与方法

1．1 药物制备

血府逐瘀汤中各药量分别为当归9g，生地9g，桃仁 12g，红花 9g，枳壳 6g，赤芍 6g，柴胡 3g，甘草6g，桔梗 4．5g，川芎 4．5g，牛膝 9g，购自福建中医药大学中医药研究院。该方水煎2次煎液过滤，混合后加热浓缩至含生药量1．3g/ml、4℃保存备用。

1．2 含药血清制备

6周龄 SD大鼠，体重150g±20g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(动物批号NO．0037614)，在福建中医药大学实验动物中心普通饲料喂养，自由饮水，随机分为药物组和空白对照组，每组6只。药物组以13g/kg剂量灌胃给予血府逐瘀汤，空白对照组采用等量生理盐水灌胃，2次/d，连续7d，于第8天给药2h后3%戊巴比妥钠麻醉、腹主动脉取血，静置1h后，4000rpm离心30min分离血清，经 56℃ 灭活 30 min，0．22μm 过滤除菌后，置－20℃保存。

1．3 试剂及设备

明胶，戊巴比妥钠(美国，SIGMA公司)，GIBCOTMM199培养基干粉，Trizol，引物(美国，Invitrogen公司)，南美胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)、

1．4 HUVECs培养及含药血清处理

HUVECs购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，采用含5%FBS的M199培养液，于37℃ 5%CO2中培养至汇合后同步化处理，以2．5×105个/ml密度接种，培养4h待细胞贴壁后弃去培养液，细胞随机分成药物组和空白组，分别更换1.25%、2．5%和5%血府逐瘀汤含药血清和空白对照血清，继续培养48h开展各项实验。

1．5 迁移实验

收集各组细胞培养上清液将其置于boyden小室的下室，中间置以0．5%明胶预包被的孔径8μm的聚碳酸酯膜，上加入对应组别的HUVECs2×104个，于37℃ 5%CO2培养箱中培养16h。聚碳酸酯膜上室面的 HUVECs以棉签轻轻刮去，下室面的HUVECs以中性甲醛固定，苏木素常规染色，400×视野下随机计数6个视野细胞数。

1．6 MMP-2和 MMP-9表达检测

采用RT-PCR法，Trizol提取细胞内总 RNA，取总RNA 1μg进行逆转录反应，操作按 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。引物序列见表1。

1．7 上清液MMP-2和MMP-9含量检测

取各组细胞培养上清液采用酶联免疫法检测，具体步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

2．1 血府逐瘀汤对细胞迁移能力的影响

迁移实验的检测结果(图1、表1)显示，3个不同血清浓度的空白对照组之间没有显著差异，与空延伸 45s，经35个循环，72℃补齐10 min后电泳检测 白对照组相比，2．5% 和5．0%的含药血清可提高细胞的迁移能力，使得迁移到下室面的细胞数量明显升高(P＜0．01)。

表1 EUSA检测结果

图1 血府逐瘀汤影响内皮细胞迁移的实验结果(×200)

表2 血府逐瘀汤对内皮细胞迁移及Ⅳ型胶原酶的影响结果(±s，n=6)

表2 血府逐瘀汤对内皮细胞迁移及Ⅳ型胶原酶的影响结果(±s，n=6)

注:与相同血清含量的空白组比较:*P ＜0．05，#P ＜0．01

检 测 项 目 含药血清量(%)空白血清量(%)1．25 2．5 5 1．25 2．5 5迁移数量(个) 47．50 ± 4．85 59．17 ± 7．03# 62．00 ± 6．36#38．00 ± 6．13 42．67 ± 6．06 43．17 ± 5．12 MMP-2 含量(ng/ml) 208．00 ±18．56 258．33 ±14．99# 289．50 ±10．01# 200．00 ±17．41 200．00 ±17．41 225．67 ±23．45 MMP-9 含量(pg/ml) 342．50 ±17．67 519．67 ±25．56* 608．83 ±33．18# 357．00 ±28．31 458．33 ±35．99 533．50 ±21．33 MMP-2 表达灰度值 0．18 ± 0．01 0．22 ± 0．01# 0．22 ± 0．01# 0．16 ± 0．01 0．18 ± 0．01 0．17 ± 0．01 MMP-9 表达灰度值 0．54 ± 0．01 0．67 ± 0．02# 0．71 ± 0．02#0．55 ± 0．01 0．56 ± 0．02 0．56 ± 0．02

图2 血府逐瘀汤影响Ⅳ型胶原酶表达的RT-PCR实验结果

2．2 血府逐瘀汤对MMP-2和MMP-9表达的影响

RT-PCR的检测结果(图2、表1)表明，与相同血清浓度的空白对照组相比，2．5% 和5．0%含药血清可显著提高MMP-2和MMP-9的转录水平(P＜0.01)。

2．3 血府逐瘀汤对 MMP-2和 MMP-9含量的影响

ELISA检测结果(表1)显示，从3个不同血清含量的空白组来看，细胞培养上清液中MMP-2含量与血清浓度无关，而MMP-9水平随着血清含量的升高呈上升趋势，以5%空白血清组的含量最高，说明培养体系中的血清含量仅影响MMP-9的分泌。为了撇清血清的影响因素，采用药物组与同等血清含量的空白组相比，其中2．5% 和5．0%含药血清均可显著提高上清液中MMP-2和MMP-9的水平，较低浓度的药物无显著影响，提示药物具有提高MMP-2和MMP-9含量的作用。

3 讨论

基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)因其活性需要 Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，MMPs几乎能降解细胞基质中的各种蛋白成分，在肿瘤侵袭、细胞迁移中发挥关键性作用进并日益受到重视。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员，根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为4类，而对Ⅳ型胶原酶的研究较深入。Ⅳ型胶原酶包括非糖化明胶酶A(MMP-2)和糖化明胶酶B(MMP-9)，两者在结构上除含有该家族所共有的氨基末端和锌离子结合区域外，还在催化部位含有区别于其他家族成员的类似Ⅱ型类纤黏连蛋白的明胶结合部位，最大的结构差异在于MMP-9多了一段长度为54个氨基酸残基的富含脯氨酸序列。它们都以酶原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，通过降解、破坏靠近细胞外基质中的各类胶原和明胶等蛋白，使细胞沿着缺失的基质膜向周围组织迁移。

细胞基质的水解和重建是血管新生所有步骤中最为重要的、影响到内皮细胞迁移和管腔的形成［8］，MMP-2和 MMP-9蛋白抑制剂能极大减弱内皮细胞的迁移［9］，MMP-2和 MMP-9缺失小鼠血管新生减弱［10-12］，而其抑制剂具有抑制血管新生的作用［13、14］，且内皮细胞分泌的 MMP-2 无论对生理或病理性血管新生的具体步骤，包括内皮细胞增殖、分化和迁移等都是必不可少的［15、16］。本实验结果说明，血府逐瘀汤可通过升高MMP-2和MMP-9的表达水平，提高内皮细胞的迁移能力，进而发挥促血管新生作用。

MMPs的活性受到基因表达、酶原激活以及特异性抑制因子3个水平的调节。本实验针对药物影响Ⅳ型胶原酶基因表达这个环节展开探讨，要全面明确Ⅳ型胶原酶在血府逐瘀汤促内皮细胞迁移中的作用机制，还需要从另外两方面进一步深入研究。此外，联系本项目组以往的研究工作我们发现，血府逐瘀汤促内皮细胞的迁移作用不仅与本研究的MMPs相关，还与VEGF、bFGF和 NO等血管新生调控因素关系密切［6］，这个现象不仅验证了药物促血管新生的作用机制呈多途径、多靶点的结论，而且为今后的探索拓展了新思路。

［1］GAO Dong，WU Li-ya，JIAO Yu-huan，et al．The Effect of Xuefu Zhuyu Decoction on in vitro Endothelial Progenitor Cell Tube Formation［J］．Chin J Integr Med，2010，16(1):50-53．

［2］高 冬，宋 军，胡 娟，等．活血化瘀中药对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响［J］．中国中西医结合杂志，2005，25(10):912-915．

［3］高 冬，陈文元，吴立娅，等．血府逐瘀汤诱导内皮细胞促血管新生的基因调控研究［J］．中国中西药结合杂志，2010，30(2):153-156．

［4］高 冬，吴立娅，焦雨欢，等．血府逐瘀汤对内皮祖细胞功能的影响［J］．中药材，2010，33(7):1129-1132．

［5］高 冬，吴立娅，焦雨欢，等．血府逐瘀汤影响内皮祖细胞分化的实验研究［J］．中国中医基础医学杂志，2009，15(12)917-919．

［6］高 冬，陈文元，吴立娅，等．血府逐瘀汤诱导内皮细胞迁移的机制研究［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(16):120-124．

［7］Lamalice L，Le Boeuf F，Huot J．Endothelial cell migration during angiogenesis［J］．Circ Res，2007，100(6):782-794．

［8］Visse R， Nagase H． Matrix metalloproteinasesand tissue inhibitors of metalloproteinases:structure，function and biochemistry［J］．Circ Res May 2，2003，92(8):827-839．

［9］Koivunen E，Arap W，Valtanen H，et al．Tumor targeting with a selective gelatinase inhibitor［J］．Nat．Biotechnol Aug，1999，17(8):768．

［10］Itoh T，Tanioka M，Yoshida H，Yoshioka T，Nishimoto H，ItoharaS:Reduced angiogenesis and tumorprogression in gelatinase A-deficient mice［J］．Cancer Res，1998，58:1048-1051．

［11］Vu TH，Shipley JM，Bergers G，Berger JE，Helms JA，Hanahan D，Shapiro SD，Senior RM，Werb Z:MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes［J］．Cell，1998，93:411-422．

［12］Zhou Z，Apte SS，Soininen R，Cao R，Baaklini GY，Rauser RW，Wang J，Cao Y，Tryggvason K:Impaired endochondral ossification and angiogenesis in mice deficient in membrane-type matrix metalloproteinase I［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:4052–4057．

［13］Qi JH，Ebrahem Q，Moore N，Murphy G，Claesson-Welsh L，Bond M，Baker A，Anand-Apte B:A novel function for tissue inhibitorofmetalloproteinases-3 (TIMP3):inhibition of angiogenesis by blockage of VEGF binding to VEGF receptor-2［J］．Nat Med，2003，9:407-415．

［14］Seo DW，Li H，Guedez L，Wingfield PT，Diaz T，Salloum R，Wei BY，Stetler-Stevenson WG:TIMP-2 mediated inhibition of angiogenesis:an MMP-independent mechanism［J］．Cell，2003，114:171-180．

［15］HandsleyMM， EdwardsDR． Metalloproteinasesand their inhibitors in tumor angiogenesis［J］．Int J Cancer，2005，115:849-860．

［16］Nguyen M，Arkell J，Jackson CJ．Human endothelial gelatinases and angiogenesis［J］．Int J Biochem Cell Biol，2001，33:960-970．

The effect of type IV collagenase on endothelial cell migration induced by Xuefu Zhuyu Decoction

GAO Dong1，CHEN Wen-yuan1，ZHENG Liang-pu2，LIN Wei2，WU Li-ya1，SONG Jun3△，CHEN Kei-ji4
(1．College of Integrative Medicine，Fujian University of Tradition Chinese Medicine，Fuzhou350108，China;2．Fujian Academy of Integrative Medicine Fuzhou350108，China;3．The Experimental Research Center China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China;4．Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100091，China)

Objective:To investigate the effect of type IV collagenase on endothelial cell migration induced by Xuefu Zhuyu Decoction(XFZYD)．Methods:Serum pharmacology technique was adopted．Endothelial cells ECV304 were treated with blank serum or XFZYD containing serum(XFZYD-CS)at final concentrations of 1．25% ，2．5%and 5% ．Boyden chamber assay was performed to test cell migration function．ELISA and RT-PCR was used to estimate MMP-2 and MMP-9 level in cell supernatant and their transcription．Results:Final concentration of 2．5%and 5%XFZYD-CS promoted cell migration as well as MMP-2 and MMP-9 level and their transcription remarkably．Conclusion:XFZYD could induce ECV304 migration through high expression of MMP-2 and MMP-9．This might account for partial mechanism of angiogenesis effect induced by XFZYD．

Xuefu Zhuyu Decoction;cell migration;MMP-2;MMP-9

R285．5

B

1006-3250(2012)01-1341-02

国家自然科学基金项目(81072933);福建省自然科学基金项目(2007J0101);福建省“中西医结合基础与临床”创新团队项目(CKJ2008001)

2011-07-11

高 冬(1967-)，女，教授，医学硕士，从事血管新生研究，Tel:0591-22861151，E-mail:gd1026@yahoo．com．cn。

△通讯作者:宋 军，Tel:010-64014411-3325，E-mail:junsong86@sohu．com。