补肾活血合剂对糖尿病性阳痿大鼠阴茎平滑肌组织作用机理的实验研究*

张国豪，方再军，张国治

(1．中国中医科学院广安门医院，北京 100053;2．贵州茅台酒厂职工医院，贵州 仁怀 564501;3．仁怀市人民医院，贵州 仁怀 564500)

补肾活血合剂对糖尿病性阳痿大鼠阴茎平滑肌组织作用机理的实验研究*

张国豪1，方再军2，张国治3

(1．中国中医科学院广安门医院，北京 100053;2．贵州茅台酒厂职工医院，贵州 仁怀 564501;3．仁怀市人民医院，贵州 仁怀 564500)

目的:观察补肾活血合剂对糖尿病(DM)性阳痿(ED)大鼠阴茎半滑肌组织的作用机理。方法:将实验小鼠用2%链脲佐菌素液按60mg/kg，腹腔注射建立糖尿病模型，然后在每只糖尿病模型大鼠颈项处注射阿朴吗啡80ug/kg，录像记录阴茎勃起次数。筛选DM性ED模型，将DM性ED模型随机分为正常组、模型组、中药高、低剂量组、达美康组、达美康 +安雄组。除正常组外，其余各组连续给药l2周，然后处死测定阴茎海绵体胶原纤维，血窦结构，平滑肌组织病理改变。结果:补肾活血活剂对胶原纤维，血窦结构，平滑肌有改变。结论:补肾活血合剂对糖尿病阳痿大鼠阴茎平滑肌有明显效果。

补肾活血合剂;糖尿病;阳痿;阴茎海绵体平滑肌

阴茎勃起功能障碍为糖尿病常见的慢性并发症，其发病机理医学界分别从血管、神经、内分泌，约物及心理因素等方面进行了探讨，但发病机理仍不很清楚。本文通过建立DM性 ED大鼠模型，主要从DM性ED大鼠阴茎平滑肌功能作用机理方面，通过免疫组化实验研究探讨中药对糖尿病性阳痿的防治机理，现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 药品 补肾活血合剂(山淫羊藿、葛根、川芎等组成，生药2g/ml，由四川省人民医院制剂室制备;达美康，法国施维雅药厂、天津华津制药厂合作(80mg/片);安雄，南京欧加农制药有限公司(40mg/粒)。

1．1．2 动物 健康 SD雄性大鼠 l20只，体重250g～300g，由成都中医药大学实验动物中心提供。

1．1．3 仪器 日立全自动生化分析仪(型号7170-A)，Y-计数仪(型号 FJ200δ P，西安二六二厂)，O1ymPus光学显微镜(日本)，MIAS-2000型图形图像分析系统，四川大学图形图像研究所提供。

1．2 方法

1．2．1 动物造模及分组 造模方法:禁食8h后，新鲜配制2%链脲佐菌素液按60mg/kg，对110只大鼠分别左下腹腔内注射，5d后取血(取血前禁饲8h)，分离血清送成都中医药大学附院检验科检测血糖，选取血糖值在 11．1mmol/L～22．2mmol/L的大鼠进入试验。

阴茎勃起试验 仿照文献［1］造模方法。将大鼠放观察箱适应环境10 min，然后在每只大鼠颈项处注射阿朴吗啡80ug/kg，AP0溶解于0．5mg/kg生理盐水中，调整体积为5ml/kg。每只大鼠观察30 min，录像记录阴茎勃起情况及勃起次数。阴茎头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起1次，然后筛选ED病例作为DM性ED动物模型。SD大鼠110只共造成DM模型 98只，98只中有 ED者61只，DM并ED62%，随机分成5组:正常组:10只;模型组:12只;中药高剂量组(相当于成人剂量 10倍 5．4g/kg):12只;中药低剂量组(相当于成人剂量5倍2．7g/kg):12只;达美康组(相当于成人剂量10倍22．86mg/kg):12只;达美康+安雄组(相当于成人剂量10倍22．86mg/kg+11．84mg/kg):12只。以上各组均自由饮水，除正常组10只外，各组动物均为12只，以上各治疗组连续给药12周后，经股动脉放血处死，摘除阴茎并测定阴茎体积及做相关免疫组化测定。

1．3 观测指标与测定方法

1．3．1 阴茎体积 用水取代法测量阴茎体积(单位 ml)。

1．3．2 血糖 用酶法检测。

1．3．3 染色方法 阴茎海绵体胶原纤维、血窦结构、平滑肌组织，用Masson三色染色法。

1．3．4 病理学检测方法 (1)阴茎海绵体组织结构的观察:取相同部位阴茎海绵体组织(阴茎中后段)，10%中性甲醛液固定48h，逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片8张，切片厚度4μm，其中第1张切片做Masson染色，第2～8张切片做免疫组化染色，操作步骤根据文献［2］操作。在200×镜下观察Masson染色片阴茎海绵体组织结构的变化。结果胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，红细胞呈橘红色;(2)Masson染色分析:每张切片随机取5个视野(200×)，定量测染色为红色平滑肌，绿色胶原纤维和血窦的面积等二维参数。胶原表示，阴茎海绵体中胶原成分的变化，平滑肌表示阴茎海绵体组织中平滑肌成分的变化，血窦表示阴茎海绵体血管系统变化，以上变化反映对阴茎舒张的影响。

1．4 检测指标的意义

1．4．1 面积 截面的面积是形态定量分析中常用的参数。截面的面积等于落在截面内的像素点计数乘以每个测试像素点所代表的测试面积(a=d2k2Pc)，单位 um2。

1．4．2 积分光密度(IOD) 表述被测个体截面积内光密度的积分值，亦即是吸光物质的总含量，IOD越大，说明测定物质的量或染色反应后颜色越深，故量越多。

1．4．3 平均光密度 表述被测个体截面或投影轮廓单位面积内吸光物质各像素光密度的平均值，由积分光密度除以测试框内像素数目获得。

1．4．4 平均黑度 即平均灰度，指被分析的图像各部分染色颜色的平均深浅度，平均黑度越大，即染色越深，被染物质的量越多。

2 统计学处理

3 结果

3．1阴茎体积

表1显示，各组实验大鼠阴茎体积比较无多大变化，比较无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠阴茎体积比较(±s)

表1 各组大鼠阴茎体积比较(±s)

组别 例数(只) 体积(单位ml3)正常组中低组模型组达美康组中高组达 +安 组10 99999 0．45 ±0．15 0．40 ±0．11 0．38 ±0．16 0．40 ±0．17 0．41 ±0．20 0．39 ±0．18

3．2 阴茎胶原纤维、血窦和平滑肌

表2～4图1～4显示，模型组与正常组比较，胶原纤维含量增多;血窦的周长和面积变小，窦腔变窄;平滑肌面积、平均黑度、平均光密度和积分光密度比正常组少。经用中药制剂治疗后，阴茎胶原纤维含量减少，窦腔扩张;平滑肌面积、平均光密度、积分光密度和平均黑度增多，与模型组比较有显著性差异(P ＜0．01)。

表2 各组大鼠阴茎海绵体胶原纤维含量比较(±s)

表2 各组大鼠阴茎海绵体胶原纤维含量比较(±s)

注:与正常组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01;与模型组比较:#P ＜0．05，##P ＜0．01(下同)

组 别 例数(只) 面积(μm2)平均光密度 积分光密度 平均黑度正 常 组 10 1579．08 ±1197．04 156．97 ± 7．40 305935．06 ± 207957．92 65．11 ± 8．34中 低 组 9 3064．39 ±1258．43## 166．95 ±36．57## 496624．26 ± 250012．74## 71．38 ± 9．80##模 型 组 9 8878．89 ±4366．14＊＊ 192．47 ±11．34＊＊ 1486841．71 ± 703910．69＊＊ 98．03 ± 7．40＊＊达 美 康 组 9 3970．95 ±1188．60## 185．30 ± 6．35## 564935．47 ± 331737．92## 74．05 ±17．51##中 高 组 9 2549．48 ±1604．48## 159．89 ± 8．34## 424421．62 ±4610420．26## 69．69 ± 6．35##达 + 安 组 9 4537．86 ±3227．88## 190．95 ±17．51## 784929．65 ± 234494．98## 95．84 ±37．28##

3．3 血糖

表5显示，从各组实验大鼠比较可知，经治疗后各组与模型组比较血糖值下降有显著性差异(P＜0．01)。

表6显示，模型组同治疗各组治疗前后空腹血糖值无显著性差异，与正常组比较有显著性差异绵体平滑肌纤维受损、细胞数目减少、结缔组织增多、血管粥样硬化，血管障碍等有关［3、4］。

表3 各组大鼠阴茎海绵体血窦结构的比较(±s)

表3 各组大鼠阴茎海绵体血窦结构的比较(±s)

组 别 例数(只) 面积(μm2) 周长(um) 最大直径(um)正 常 组 10 9523．16±4137．98 493．87±122．22 150．07±16．73中 低 组 9 8505．49 ±4571．58 435．22 ±137．77 135．78 ±15．68模 型 组 9 4800．48 ±2306．33＊＊ 347．47 ±94．33 96．74 ±23．17＊＊达 美 康 组 9 5718．13 ±2038．76 398．91 ±150．53 118．86 ±38．07中 高 组 9 9254．00 ±1106．72## 493．22 ±127．49## 142．28 ±24．76##达 + 安 组 9 5447．37 ±2464．91 352．49 ±184．33 105．43 ±35．19

表4 各组大鼠阴茎海绵体平滑肌组织比较(±s)

表4 各组大鼠阴茎海绵体平滑肌组织比较(±s)

组别 例数(只) 面积(μm2)平均光密度 积分光密度 平均黑度正 常 组 10 522．02 ±225．04 195．62 ±10．94 1955612．49 ±3950075．09 89．38 ± 10．94中 低 组 9 387．49 ±132．47## 185．08 ±12．78## 85671．76 ± 33466．75## 76．12 ± 8．25##模 型 组 9 288．24 ±117．41＊＊ 152．69 ±11．48＊＊ 43400．86 ± 26303．79＊＊ 61．65 ±12．12＊＊达 美 康 组 9 362．58 ±315．54## 178．88 ± 8．25## 74152．93 ± 58791．84## 69．70 ± 7．36##中 高 组 9 495．74 ±182．78## 185．88 ±16．72## 97742．03 ± 30661．30## 79．92 ±12．78##达 + 安 组 9 346．21 ±144．64## 175．29 ± 7．36## 49484．59 ± 49290．93## 69．13 ±16．72##

表5 各组大鼠治疗后空腹血糖(FBG)比较(±s)

表5 各组大鼠治疗后空腹血糖(FBG)比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0．01;与模型组比较:#P＜0.05，##P ＜0．01，治疗前后比较:△P ＜0.05，△△P ＜0．01

组别 例数(只) 治疗前mmol/L 治疗后mmol/L正 常 组10 6．25 ± 1．03 7．01 ± 1．12中 低 组 9 13．98 ±2．07△△ 10．45 ±1．21*##模 型 组 9 14．19 ±2．27△△ 31．88 ±4．59达 美 康 组 9 14．09 ±2．25△△ 8．96 ±2．42＊＊##中 高 组 9 14．01 ±3．15△△ 8．56 ±3．05＊＊##达 + 安 组 9 3．88 ±2．14△△ 8．87 ±3．17＊＊##

在正常情况下，阴茎海绵体平滑肌松弛，动脉血管扩张，血流加快，阴茎胀大，阴茎海绵体压力增强，静脉闭阻，使达到能性交的勃起状态，阴茎海绵体平滑肌细胞在勃起过程中具有关键作用。

组织学研究显示，阴茎动脉供血不足，海绵体内胶原聚集导致勃起功能障碍，超微结构的特征性改变使血管性勃起功能障碍的患者平滑肌细胞再生不良和萎缩及细胞外基质(主要是胶原纤维)聚结。海绵体内胶原成分的增加和海绵体血窦内平滑肌细胞数的下降与勃起功能障碍有关。

勃起功能障碍病理在于海绵体平滑肌的改变，糖尿病并勃起功能障碍的病理表现在:平滑肌纤维数量减少，神经组织受体减少或缺乏。特别是细胞内收缩和舒张的基本结构成分肌原纤维有明显损害、早衰，胶原纤维增生，海绵体纤维化，从而使平滑肌收缩和舒张功能受到严重损害。在血管方面，阴茎小动脉内膜增厚，内皮下层水肿，中膜肌层的肌纤维分离、纤维增生和钙化，严重者则管腔狭窄。

本实验采用免疫组织和Masson染色(显示平滑肌细胞胶原组织和血窦)对阴茎海绵体染色结果进行测量，显示海绵体平滑肌、胶原纤维及血窦之间的关系。结果表明，中药制剂治疗后阴茎胶源纤维含量减少，窦腔扩张，平滑肌面积，平均光密度、积分光密度和平均黑度增多，说明中药制剂具有改善阴茎胶原纤维、血窦和平滑机作用。

中医学理论认为，阳痿与消渴病病机演化密切(P＜0．01)，经治疗后，治疗各组与模型组比较血糖值下降(P ＜0．01)。

4 讨论

阳痿即勃起功能障碍，其病理改变为平滑肌减少，胶原纤维发生增生，常表现为阴茎海绵体纤维化［3］。阳痿是糖尿病常见并发症，主要是与糖尿病变引起外周血管疾病，特别是血管内皮细胞凋亡、海相关。消渴病病理本质是阴虚燥热，阴损及阳，转化为气阴两虚，阴阳俱损，肾阳不振，温煦失职，则前阴不能振奋而勃起，无论是气阴两虚，阴阳俱损，命门火衰，都容易造成瘀血内阻，消渴并发阳痿，在瘀血的病机上都与肾密切相关，治疗上补肾活血，温阳振痿。补肾活血合剂淫羊藿、川芎、葛根等组成，该方具有温肾壮阳，活血化瘀，降糖起痿功效。药理研究表明，淫羊藿具有提高性机能，增加附性器官重量，提高血浆睾酮含量［5］，葛根、川芎活血化瘀，能使微循环血流加速，增大管径，抑制血小板聚结，葛根素能降低血糖，因此该处方组成约物具有改善糖、脂代谢［6～9］，改善血液循环，提高机体免疫功能及抗衰老、提高性功能。抗自由基损伤，抑制脂质过氧化和改善血管活性调节平滑肌舒张作用。通过以上综合作用，保护阴茎海绵体平滑肌，抑制海绵体平滑肌及血窦，胶原纤维的病理改变。

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Experimental study on effect of Bushen Huoxue Heji on the tissue of corpus cavernosum smooth muscle in diabetic impotence rats

ZHANG Guo-hao，FANG Zai-jun，ZHANG Guo-zhi
(1．Guang anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Science，Beijing100053，China;2．Hospital of Mao-Tai Chiew Factory in Guizhou Province，Renhuai，Guizhou564501，China;3．People’s Hospital of Renhuai，Renhuai，Guizhou564501，China)

Objective:Observing the effects of the reinforcing kidney and activating blood recipe affecting the tissue of corpus cavernosum smooth muscle of DMED-rats．Methods:An animal model of diabetes was induced by a single intravenous dose of streptozotocin(STZ，60mg/kg body weight)in Wistar rats．Recording the numbers of penile erection of eath rat by camera after subcutaneous inject of apomorphine(80μg/kg)．Screening the modle of STZ-rats with erectile dysfunction and grouping into 6 groups:control group，modle group，Chinese Medicine group，low-dosage group，Diamicron group，Diamicron combined Testosterone Undecanoate group，After administrating 12 weeks，observed the change of collagenous fiber of The penis sponge body，Blood sinus structure and the Organization pathological changes of Smooth muscle tissue Organization pathological changes．Results:the reinforcing kidney and activating blood recipe can improve the value of collagenous fiber of corpora cavernosa penis，Blood sinus structure and the Organization pathological changes of Smooth muscle tissue Organization．Conclusion:the reinforcing kidney and activating blood recipe has significant profective effect of the tissue of corpus cavernosum smooth muscle of DMED-rats．

reinforcing kidney and activating blood recipe;diabetes mellitus;erectile dysfunction;The penis sponge body smooth muscle

R285．5

B

1006-3250(2011)12-1338-03

贵州省中医药管理局重点项目(黔中发2005-30)

2011-02-26

张国豪(1968-)，男，贵州茅台人，副主任医师，硕士研究生导师，博士后，从事中西医结合防治内分泌系统和心血管系统疾病的临床、科研与教学，Tel:13158126293，E-mail:mt zhang guo hao 163．com。