长期递增负荷运动对雌性大鼠胫骨上段骨组织形态计量学的影响

陈晓红 郑陆 朱一力 李青南 王宏梅

1 首都体育学院（北京 100088） 2 广东药学院

运动与骨代谢密切相关，其效应表现为骨量（BMD、BMC）改变，以及在此基础上的骨质增强或减弱。人体实验证实，长期大负荷运动使女运动员出现月经周期紊乱，骨密度降低[1-3]，甚至产生应力性骨折[4，5]。动物实验结果也发现，大负荷运动使大鼠出现动情周期抑制[6]，骨量下降[7]。但尚缺乏对于大负荷运动及过量运动致骨量降低机制的研究。本研究通过测定递增负荷大鼠胫骨上段骨组织形态计量学指标，从组织学和细胞学水平阐释过量负荷运动骨量降低的静、动态变化特点，及其可能机制，为丰富骨质疏松的病理机制理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

3月龄未经交配的雌性SD大鼠154只，体重269.51 ± 12.51 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。分笼饲养，自由进食、饮水，以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。环境温度18～24℃，相对湿度45～55%，通风良好。

1.2 动物分组及训练方案

实验开始前所有大鼠进行一周的适应性训练，将进行运动的大鼠分为8组，按照负荷设定标准分别进行2、4、6、8、9、11、13、15周的递增负荷运动，每组 10 只（T2、T4、T6、T8、T9、T11、T13、T15）。同期设立与运动组相对应的对照组，每组8只（C2、C4、C6、C8、C9、C11、C13、C15）。10 只 3月龄大鼠设为基础对照组（BC）。运动组大鼠采用杭州段氏PT2000型跑台进行训练，每周运动6天，休息1天。负荷设定参照Bedford[8]运动负荷标准和郑陆等[6]建立的运动性动情周期紊乱动物模型的负荷标准。具体的负荷设定标准如表1。

表1 大鼠运动负荷的设定

1.3 骨骼前期处理及骨密度测定

按计划将大鼠分批处死。处死前第13和14天腹部皮下各注射一次盐酸四环素（25 mg/kg）；第3和4天颈部皮下各注射一次calcein（5 mg/kg）。大鼠以3%戊巴比妥钠行腹腔麻醉（30 mg/kg体重）。以双能X线骨密度扫描仪（lunar prodigy）测量大鼠全身骨密度（bone mineral density，BMD）。大鼠处死后，取右侧胫骨，剔除软组织，进行骨组织形态计量学测量。

1.4 骨组织形态计量学制样

用慢速骨锯（Bushler LTD，USA）将大鼠胫骨锯为3段，取胫骨近心端，沿胫骨粗隆行冠状面切开，暴露骨髓腔。经系列脱水、甲基丙烯酸甲酯不脱钙骨包埋、硬组织切片机（LEICA RM2255）切片，以BIOQUENT图像系统对骨切片进行形态观察和分析计量。

1.5 统计学分析

使用Excel 2003建立数据库，用SPSS for windows 11.0软件处理，结果以平均数±标准差（mean ± SD）表示，以Independent-sample t Test对运动组及对照组大鼠的实验数据进行显著性检验；并以One-way ANOVA对大鼠骨形态计量学参数进行组间差异比较。检验水准P = 0.05，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 大鼠全身骨密度

表2显示，大鼠骨密度随年龄增加呈升高趋势，在训练前半程各运动组（T2-9）骨密度亦有所增加，但T9-13各组骨密度值基本恒定，略低于同期对照组，但无显著差异，至T15组显著低于对照组（P <0.001）。

表2 大鼠骨密度变化（g/cm2）

2.2 胫骨上段松质骨形态计量学结果

2.2.1 静态参数

表3 各组大鼠胫骨上段松质骨静态参数比较

表3显示，各对照组静态参数%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp之间无显著性差异。各运动组大鼠%Tb.Ar呈微弱上升后急剧下降趋势，峰值出现在T11周，T13和T15组均与同期对照有显著性差异。Tb.Th与%Tb.Ar趋势一致。Tb.N则随运动时间增加持续下降，T15组为最低点，和C15组比较有显著性差异。BC至T11组Tb.Sp值基本持平，但T13组及T15组明显上升，与同期对照组相比分别增加36.81%和75.65%，并有统计学意义。

2.2.2 动态参数

表4显示，各组大鼠胫骨上段动态参数（%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV）的变化见表4，BC至C15组大鼠的%L.Pm波动较大，但各组间无显著性差异；MAR渐趋下降，除C15与BC组之间有显著性差异外，各对照组间无显著性差异；BFR/BS和BFR/BV也呈波浪式下降，各组间亦无显著性差异。

BC至T15各组%L.Pm的变化趋势为先下降后上升，T11组降至最低点，并与同期对照组有显著性差异。BC-T13各组的MAR持续下降，T13组最低（与BC相比下降33.10%），T15组略有回升，运动各组与同期对照组相比均无显著性差异。BFR/BS、BFR/BV的变化趋势较为一致，呈先下降后上升，T11组达最低点，T11和T15组的BFR/BV与同期对照相比有显著性差异。

表4 各组大鼠胫骨上段松质骨动态参数比较

2.2.3 细胞参数

表5显示，各对照组大鼠细胞参数Oc.N、Oc.Pm%随月龄增加呈先降低后持平趋势，C11组、C13组和C15组Oc.N、Oc.Pm%与BC组相比有显著性差异；C4组Ob.N、Ob.Pm%在最高点，以后略下降。

BC组至T15组Oc.N、Oc.Pm%变化趋势为先降后升，T11组达最低点并与同期对照组相比有显著性差异。BC组至T11组Ob.N、Ob.Pm%大致持平，后明显升高。

表5 各组大鼠胫骨上段松质骨细胞参数比较

3 讨论

3.1 长期递增负荷运动对大鼠骨密度的影响

从各组大鼠BMD均值可以看出，BMD随年龄增长呈波浪式上升趋势，说明本研究所选大鼠处于骨量上升阶段。3月龄大鼠骨量尚未达到峰值[9]，随着月龄增加，大鼠骨量在7～10月龄逐渐达到最大值[10]。T2～T9组大鼠BMD虽有所增加，但与相应对照组无显著性差异。由于实验所用大鼠处于生长发育期，其BMD升高可能系增龄和运动负荷综合作用的结果。这或许意味着前9周的运动负荷对骨组织而言相对较低，对骨代谢的刺激效果较弱；另一种可能的解释是，骨的重建过程相对较慢，运动所致骨量的变化亦需要较长时间方能显现，9周运动训练可能尚不足以引起骨量改变。运动训练9周后，随着运动负荷增加，大鼠BMD呈下降趋势，至T15组与同期对照组有显著差异（P < 0.001）。可见大鼠骨量增长受长时间大负荷过量运动影响而受到抑制，其原因除与运动负荷本身有关外，机体内分泌紊乱、HPO轴受抑、雌激素水平低下等为重要原因[11]。

3.2 递增负荷运动对大鼠胫骨上段松质骨骨形态

计量学指标的影响

3.2.1 递增负荷运动对大鼠胫骨上段松质骨静态参数的影响

本实验中，各对照组大鼠%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp无显著性差异，其中%Tb.Ar最高点出现在5.5月龄左右，这与刘晓青等[12]的报道一致。由此可见，3～7月龄大鼠松质骨骨小梁总面积及骨结构变化不大，处于相对稳定状态。但同期结果显示，大鼠全身BMD随月龄增加有明显增加趋势，由此推测3～7月龄大鼠全身骨密度增加与松质骨骨小梁结构无关，可能来自于皮质骨改变，或者与松质骨中骨小梁钙沉积量明显增加有关。

各 运 动 组 大 鼠 %Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和TB.Sp的变化趋势不尽相同，但各指标变化的转折点基本出现在运动11周前后。截止运动11周，运动组大鼠%Tb.Ar和Tb.Th呈缓慢升高趋势，Tb.N呈缓慢降低趋势，Tb.Sp水平几乎恒定，各指标变化与同期对照组相比均无显著差异。可见，前11周的运动训练对大鼠胫骨上段骨小梁产生正性刺激作用，使%Tb.Ar小幅增加，其增加原因可能与骨小梁厚度（Tb.Th）增加有关，换言之，前11周的运动使大鼠胫骨上段骨小梁增粗增大，而数量略下降，骨小梁结构的这种变化特征可能是骨骼在运动负荷刺激下所产生的适应性变化。而此时大鼠全身BMD缓慢升高并维持在较高水平，与%Tb.Ar和Tb.Th的增加一致。但这些指标的增加幅度有限，其原因可能与这种阈值负荷下的良性刺激对大鼠骨骼的作用时间偏短（仅11周），效果尚未充分显现有关。有理由推测，假若维持此运动负荷，延长运动训练周期，骨量可能会明显增加。

T13组和T15组大鼠%Tb.Ar明显下降，与同期对照相比分别下降33.2%和48.6%，有显著性差异；同时，Tb.Th、Tb.N均下降，Tb.Sp急剧升高，并与同期对照比较差异显著。此与Bourrin等[13]的研究结果一致。由此可见，在递增负荷运动下，T13组和T15组大鼠松质骨数量和骨结构陡然下降。于顺禄等[14]认为，无论何种原因造成的骨质疏松，%Tb.Ar值如低于正常（或对照标准）的15%，就应视为骨质疏松症。故T13组和T15组大鼠已出现明显的骨质疏松。此外，T15组大鼠全身BMD亦显著降低，说明持续的递增负荷最终不仅导致大鼠松质骨骨小梁面积减小、骨结构变差，还使大鼠全身骨密度显著降低，出现运动性骨量降低。值得注意的是，本实验模型大鼠的骨组织形态学特点与去卵巢骨质疏松模型相似，大鼠去卵巢后，其松质骨骨小梁面积、数量减少，骨小梁分离度上升[9，15]。本研究中，运动组大鼠全身BMD降低的时间明显滞后于骨组织形态计量学指标的变化，该结果与赵烨等[16]的研究一致，也进一步证实骨组织形态计量学技术作为一种先进的骨代谢评价手段，其早期、灵敏等特点有助于发现骨质的早期变化。

3.2.2 递增负荷运动对大鼠胫骨上段松质骨动态参数及细胞参数的影响

动态参数反映骨表面矿化的量和速率，并可以解释静态参数变化的原因。本研究中，BC组至C15组大鼠%L.Pm呈先上升后下降趋势，其中C4（4月龄）组最高，但各组间无显著性差异；MAR、BFR/BS、BFR/BV均渐次降低，提示3～4月龄大鼠成骨细胞活性及骨形成率处于巅峰状态，其原因是此阶段大鼠胫骨上段的骨骺尚未闭合，血供和营养丰富，代谢功能活跃，骨的再生能力强，骨转换率比较高[17]。随着大鼠月龄的增加，其成骨活性及骨转化率逐渐降低，至实验结束时达最低点。同时，各对照组大鼠胫骨上段各项细胞参数亦发生相应变化，3～4月龄大鼠Oc.N、Oc.Pm%及Ob.N、Ob.Pm%高于其他月龄组，说明此月龄大鼠成骨细胞、破骨细胞数量和活性处于较高水平，骨代谢转化率较高。而后随着鼠龄增加，成骨细胞、破骨细胞数量和活性逐渐降低，骨形成和骨吸收均逐渐放缓，骨代谢转化率下降，此结果与上述动态参数结果所表达的意义一致。结合胫骨上段静态参数的变化可以发现，3～7月龄大鼠骨小梁形态和结构基本维持不变，骨形成和骨吸收均减弱，并处于动态平衡状态，骨量保持稳定[9]。

分析各运动组动态参数可以发现，BC组至T15组%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV的变化趋势均为先下降后上升，T11组达最低点；MAR呈持续下降趋势，T13组达最低点，T15组略有回升。这表明动态参数变化的转折点亦大致出现在T11组。BC组至T11组 的%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV均 呈下降趋势，说明大鼠胫骨上段成骨细胞和破骨细胞活性逐渐降低，骨形成和骨吸收同步受到抑制，骨代谢转化率逐渐下降。值得注意的是，在整个运动训练期间，运动组MAR与同期对照组比较无显著性差异，由于矿化沉积率代表每天骨表面矿化的宽度，反映骨矿化的快慢，故推测在整个运动训练期间，大鼠骨表面成骨细胞的矿化并未发生明显变化。而各运动组Oc.N、Oc.Pm%及Ob.N、Ob.Pm%也逐渐下降，这从细胞水平证实，运动训练前11周大鼠破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成均受到一定程度的抑制。但分析BC组至T11组静态参数发现，前11周的运动训练对骨小梁面积和结构略有正性刺激作用，使骨结构更趋合理，骨量增加。而在运动训练的后半程（11～15周），代表骨形成的参数（%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、Ob.N、Ob.Pm%）和代表骨吸收的参数（Oc.N、Oc.Pm%）均有明显回升，但代表骨小梁数量和结构的静态参数（骨小梁面积百分比、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨小梁分离度）出现负性改变，表明随着运动负荷的增加，大鼠的骨吸收和骨形成均明显增加，骨转化率增加，骨吸收大于骨形成，骨量下降。这种特点与绝经期妇女的骨代谢状态相似[15，18]，绝经后妇女有大量的骨重建单位参与骨的更新，骨更新率明显加速，新骨形成速度比骨吸收慢，造成骨量快速、大量丢失。

综上所述，15周递增负荷运动训练使大鼠全身BMD降低，胫骨上段骨形态计量学参数亦发生明显变化，骨形成参数（%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、Ob.N、Ob.Pm%）和骨吸收的参数（Oc.N、Oc.Pm%）均呈现先下降后上升的“V”形变化，T11组达最低点，表明在递增负荷运动11～15周，大鼠骨形成和骨吸收均加速；胫骨上段松质骨静态参数亦发生明显变化，骨小梁面积、数量及宽度均显著下降，骨小梁分离度明显升高，表明本研究的递增负荷运动使骨代谢呈现高转换状态，且骨吸收大于骨形成，骨量下降。这种变化的可能机制为：大负荷运动抑制大鼠HPO轴[19]，降低卵巢激素水平[11]，出现类似于人类绝经后骨质疏松的骨代谢特征——骨形成和骨吸收均增强，骨吸收占主导地位，骨代谢状态为高转换型。

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