萝卜辣味与黑芥子酶＊

刘春香，李洪涛，赵光强

（潍坊学院，山东 潍坊 261061）

萝卜辣味与黑芥子酶＊

刘春香，李洪涛，赵光强

（潍坊学院，山东 潍坊 261061）

综述了与萝卜辣味有关的各种因素。介绍了辣味物质的化学成份、性质、种类、分布及影响辣味物质形成的环境因素；简要描述了辣味物质的的合成途径；辣味物质对植物自身的防御作用和其他功能以及对人体的生理功能；详细介绍了黑芥子酶及其基因的研究现状，并就黑芥子酶基因与萝卜辣味的调控方面做了展望。

萝卜；辣味；黑芥子酶

萝卜（Raphanus sativus L）是一种重要的栽培蔬菜之一，种类繁多，青皮萝卜不仅作为蔬菜，同时还可以代替水果生食，尤其是以品质著称的潍县萝卜或水果萝卜。生食萝卜对品质的要求较高，辣味是萝卜品质的重要指标之一。

1 萝卜的辣味物质

萝卜的辣味是由4-甲硫基－3－丁烯异硫氰酸盐（4-Thylthio-3-Butenyl Isothiocyanate，MTB-ITC）引起的［1］。MTB-ITC为一种黄色油状物，具挥发性，能溶于水、乙醇等有机溶剂，极不稳定，在水溶液中无需酶的作用就很快分解，最后可生成黄色素［2－3］。MTB-ITC是一种硫代葡萄糖苷在黑芥子酶水解下的产物。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，又称芥子油苷，简称硫苷），是一类与生氰葡糖苷相关联的次生代谢物，广泛存在于白花菜目十字花科蔬菜中，梧桐科、番木瓜科、大戟科等科中也有零星分布，在山苷科（Capparis spinosa中［4］极少存在。

硫苷本身是一种很稳定的水溶性化合物，但在黑芥子酶作用下发生水解反应，异硫氰酸盐（isothiocyanates，ITCs）是其最主要的降解产物，不同类型的ITC对应的前体物也不同［5］。自Ettlinger等1831年首次描述硫苷以来，迄今已经有多种结构不同的硫苷被鉴定出来，这些硫苷的结构差异主要是由于其侧链的R基团替换而造成的［6］。硫苷由磺酸肟（sulfonated oxime）、β-硫代葡糖（β-thio-glucose）和一个可变的侧链（R）（side-chains）三部分构成，磺酸肟和β-硫代葡糖构成硫苷的主体，又称为硫苷的核心部分，而不同类型的硫苷则带有不同的R侧链［7］。

根据R基团的不同可分为脂肪类、芳香类和吲哚类硫苷。到目前为止，从十字花科植物中发现的硫代葡萄糖苷种类至少有120种，其中最常见的硫苷有烯丙基硫苷、苯乙基硫苷、苯甲基-4-甲硫丁基硫苷、3-甲基亚硫磺酰丙基硫苷、4-甲基亚硫磺丁基硫苷等［8］。MTB-ITC是萝卜中的硫苷，也称萝卜硫素（glucoraphenin）。

芥子油苷的生物合成途径已经比较清楚，4-甲硫基-3-丁烯异硫氰酸盐葡萄糖苷（MTB-GSL）的合成前体是氨基酸，合成过程可大致分为3个阶段：氨基酸侧链延长（链延长反应）、核心结构合成和次级修饰。氨基酸经侧链延长反应后由细胞色素P450（CYTP450）家族的CYTP79和NADPH催化转变为相应的肟（oxmie），肟再经过一系列的反应形成芥子油苷核心结构，核心结构的侧链经过各种修饰形成不同的芥子油苷。芥子油苷及其降解产物的理化性质很大程度上取决于侧链结构。

2 辣味物质的生理作用

目前已普遍认可含硫有机化合物如ITC可作为植物预防病害的物质。对昆虫及病原菌有防御作用。芥子酶与它共存，共同形成防御网络硫苷－黑芥子酶系统（Glucosinolate-Myrosinase system），该系统还对植物的生长发育、次生代谢物的产生、生长素微调等都有着很重要的意义。在植物体内，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，而黑芥子酶分布在特定的黑芥子酶细胞中。在细胞内，黑芥子酶往往与黑芥子酶结合蛋白和黑芥子酶协助蛋白形成黑芥子酶复合体催化硫代葡萄糖苷的水解。当植物组织受到损伤时，硫代葡萄糖苷与黑芥子酶直接接触，并使硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸、腈等有毒物质来保护自身免遭食草动物的伤害。其中的异硫氰酸对非专一性食草动物（generalist herbivore）和专一性（specialist herbivore）的食草动物都表现出较高的毒性，因此，硫苷－黑芥子酶系统被认为是植物与抵御取食有关的一个防御系统。硫苷的降解产物对很多真菌的菌丝都有明显的毒性作用，还对一些细菌、线虫有抑制和抵抗活性［9］。硫苷－黑芥子酶系统作为十字花科植物用以抵御昆虫侵害的化学武器，对大多数昆虫都产生毒性，但一些单食性、寡食性的害虫已突破这种化学防御机制，成为其寻找寄主的信息化合物，已证实硫苷及其水解产物对小菜蛾（Plutella xylostella L）、菜粉蝶（Pieris rapae L）等害虫的产卵与取食有引诱和刺激作用［10－11］。高泽正的研究表明黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata F）基本趋向选择硫代葡萄糖苷含量较高的蔬菜［12］；喻国泉报道小菜蛾趋向选择硫代葡萄糖苷含量较高的蔬菜上产卵［13］。

小菜蛾幼虫体内的硫酸酯酶（sulfatase）可将芥子油苷裂解为既无毒性又不能被黑芥子酶降解的去硫芥子油苷［14］。菜粉蝶体内可形成NSP（nitrile-specifier protein），直接将芥子油苷降解为腈，从而减少毒性较大的ITC的形成量，并且通过粪便将腈排出体外［15］。有些昆虫不仅可以避免芥子油苷降解，还可以利用芥子油苷形成自己的防御物质。甘蓝蚜和萝卜蚜可将摄取的芥子油苷转移至晶状微体（crystalline microbodies），与体内黑芥子酶区隔化（compartmentalization），避免产生毒性产物。当遭到病菌感染或天敌捕食后，晶状微体的完整性被破坏，芥子油苷被黑芥子酶降解为ITC。ITC可直接杀死病菌或作为警报信息素（alarm pheromone）警示同类以逃避天敌［16－17］。

黑芥子酶同几丁质酶等蛋白是从植物根中分泌出来的物质防御相关的蛋白，也是发育依赖性的蛋白，在开花时期表达量也升高，分析表明这些防御蛋白与植物的开花时间具有相关性［18］。

对于人体，MTB-ITC首先能作用于味觉神经，引起辣味，同时也有抗菌消炎和镇痛的作用，MTB-ITC对人体的不利影响是它能减少碘向甲状腺的供给，促使甲状腺肿大。萝卜中的异硫氰酸盐MTB-ITC是迄今为止蔬菜中发现最强的抗癌成分［19］。ITC以阻遏和抑制致癌因子而发挥抗癌作用［20］。ITC作为阻遏因子通过与致癌代谢中的一些关键性靶位点发生反应来预防癌症的发生，而抑制因子则在阻遏因子之后，通过抑制细胞分裂，诱导细胞程序性死亡来延迟和逆转癌症的发生。

3 辣味物质的定量分析及分布

有关辣味物质MTB-ITC在肉质根不同部位的分布，1991年Gensho做了研究，他认为在萝卜皮（韧皮部）的含量大于萝卜肉（木质部），萝卜肉中，真根部的顶端含量最高，向根头部的方向逐步减少，根头部的内层木质部含量最少［21］。当萝卜肉质根榨汁液中MTB-ITC含量低于100μmol／100m L时，辣味等级为0，多数人感觉不辣；MTB-ITC含量在100-200μmol／100m L时，辣味等级为1，多数人认为比较辣，但不影响生食；MTB-ITC含量达到200μmol／100m L或更高时，辣味平均等级则达到3以上，多数人认为辣味强烈，不适合生食。引起辣味的主要原因是由于气候炎热、干旱、肥水不足、病虫害危害、肉质根未能充分肥大等因素，导致肉质根中辣味物质含量过高［22］。可见口感辣味等级越高，MTB-ITC的含量越高。这也验证了MTB-ITC是萝卜肉质根辣味的主要物质。因此辣味强弱的划分除可用人的味觉感知外，还可以用MTB-ITC含量来表示。1966年Palle Friis用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）的方法鉴定出萝卜肉质根中存在MTB-GSL［1］。1985年Carlson［22］对109个分别来自美国、日本、韩国的萝卜品种进行测定，发现其中根部MTB-ITC的含量在100-300μmol／100g鲜重。1990年Okano提出了MTB-ITC的快速测定法并研究表明MTB-ITC的含量与萝卜肉质根辣味成正相关［23］。

4 环境对辣味物质形成的影响

萝卜中的MTB-ITC含量不仅受遗传、植物部位影响，还受环境因素的影响。刘光文提出辣味与生长期中30℃以上高温积累有关［24］，刘长荣认为辣味加重和土壤缺水有关［25］，沈奇等认为温度是影响MTBITC含量的主要因素，高温有利于MTB-ITC的积累［21］。气候对植物体内芥子油苷的组成也有影响明显［26］。一般情况下，生长在热带地区的芸苔属作物（如油菜）种子中芥子油苷的组成成分与温带地区的有很大差异。印度次大陆的油菜籽中主要含有3-丁烯基芥子苷（3-butenyl glucosionlate）、2-丙烯基芥子油苷（2-propenyl glucosinolate）以及4-戊烯基芥子油苷（4-pentenylglucosinolate），而欧洲等温带地区的油菜籽中主要是3-丁烯基芥子油苷、2-羟基-3-丁烯基芥子油苷（2-hydroxy3-butenylglucosinolate）、4-羟基吲哚-3-甲基芥子油苷（4-hrdroxyindol-3-ylmethylglucosinolate），却不含4-戊烯基子油苷［27］。有色光明显影响芜箐根部的芥子油苷含量，其中蓝光的影响最为强烈［28］，在连续单侧蓝光的照射下，萝卜（Raphanus sativus）的黄化苗胚轴（etiolated hypocotyls）中4-甲硫-3-丁烯基芥子油苷（4-methylthio-3-butenyl glucosinolate）含量下降，其降解产物4-甲硫-3-丁烯基异硫代氰酸盐（4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate）以及调节植物向光性的物质—萝卜宁（raphanusanin）迅速积累。此外，单侧蓝光使胚轴中黑芥子酶活性明显增加；相对于短日照，长日照可引起芥子油苷浓度大幅度增加。

5 黑芥子酶及黑芥子酶基因

黑芥子酶又称黑芥子硫苷酸酶，是催化芥子油苷生成ITC的水解酶，它可以耐受较高的温度和范围较大的p H值，但是较高的盐浓度对该酶的影响较大［29］。黑芥子酶存在于所有含芥子油苷植物的种子、根、茎和叶中。目前在分属15个科500多种的双子叶植物中均鉴定到黑芥子酶的存在，最近，Nong报道在番木瓜中也发现了黑芥子酶基因［30］。大量的组织学研究表明黑芥子酶存在于黑芥子酶细胞中，而黑芥子酶细胞定位于细胞原体，与蛋白体或液泡相结合。黑芥子酶在不同组织中表达不同，免疫化学分析表明，萝卜的韧皮部是黑芥子酶活性最高的部位，木质部的黑芥子酶含量较少［31］。

对十字花科蔬菜中黑芥子酶的研究较多，已有不少十字花科蔬菜的黑芥子酶基因被克隆出来，拟南芥中克隆到了6个黑芥子酶基因（TGG1-TGG6），其中TGG4和TGG5是根中表达的黑芥子酶［29］。萝卜等十字花科蔬菜中均已克隆到黑芥子酶基因，在拟南芥中还克隆到了与黑芥子酶合成相关的基因，对这些基因进行分析，可以为进一步进行硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统的研究提供基础。根据亲缘关系的远近，萝卜黑芥子酶基因与大白菜、菜心、芥菜、芥蓝聚在一组。

植物中葡萄糖异硫氰酸盐的含量和种类直接与黑芥子酶是相关的，在盐水芹的种子中只含有脂肪族的ITC，而根、花和角果中却含有芳香族、吲哚类等7种ITC，发育第四期的根中ITC含量最高而后下降与芥子酶活性相关［32］。

黑芥子酶是典型的植物糖基化酶，是ITC合成的关键酶。植物黑芥子酶是一个同源二聚体，结构与O-糖苷酶结构类似，不同之处主要在于活性中心基团的差异，在黑芥子酶活性位点上谷氨酸代替了O-糖苷酶的谷氨酰胺，昆虫体内的黑芥子酶活性位点为谷氨酰胺［33］。实际上黑芥子酶很少以游离形式存在，它与一些辅酶如黑芥子酶结合蛋白（myrosinasebinding protein，MBP）、黑芥子酶协助蛋白（myrosinaseassociated protein，MAP）等形成复合物［6］。机械损伤、昆虫取食、茉莉酸甲酯和脱落酸等因素能诱导MBP、MAP基因的转录，水杨酸则抑制其转录。在黑芥子酶的翻译后修饰过程中，糖基化与去糖基化作用可调控酶的活性［34］。

6 展望

2000年Hara克隆了萝卜黑芥子酶基因的cDNA［31］，采用黑芥子酶基因的序列，选择该蛋白质的免疫活性较强的部位，构建基因工程的载体，获得部分表达蛋白或含黑芥子酶序列在动物组织能表达的载体，免疫动物，获得抗体，通过酶联免疫方法能够检测到该酶的活性高低，可以利用这种间接参数大量检测萝卜样品，用以表示肉质根辣味物质含量。

Brigit于2010年报道了一个有趣的实验，采用黑芥子酶细胞专一性启动子Myr1.Bn1连接一个被称为barnase的核酸酶，转化油菜，在这一核酸酶的作用下，细胞会死亡，不仅黑芥子细胞，其他细胞也受影响，为了仅消除黑芥子细胞，保存其他正常发育需要的细胞，研究者又在油菜内转入了一个barnase核酸酶的抑制剂基因，利用了组成型的Ca MV35S启动子，经过这样的处理，油菜的生长正常，黑芥子细胞被消除，油菜中再也没有芥子油的辣味产生［35］。萝卜在高温等逆境下栽培会出现辣味过重的现象，那么油菜上的研究可否为研究者提供一点降低辣味的启示呢？在低温季节萝卜栽培上遇到的问题是辣味过淡，显得品质欠佳，如何平衡这一问题，是在酶的水平上调控还是在基因的水平上改变呢？黑芥子酶究竟在萝卜辣味形成的过程中是不是限制性因素，这些都是有待研究的问题，也是指导生产的重要理论基础。

［1］Friis P，Kjer A.4-Methylthio-3-butenyl isothiocyanate，the pungent principle of radish root［J］.Acta Chem Scand，1966，20（3）：698－705.

［2］Ishii G.Glucosinolate in japanese radish［J］.Rophanus Sativus L，1991，24（4），273－279.

［3］沈奇，汪隆植.萝卜肉质根的辣味物质研究［J］.中国蔬菜，1996，（5）：52－54.

［4］Rodman J E.A taxonomic analysis ofglucosinolate producing plants PartⅠ［J］.Phenetics Systemic Botany，1991，16（4）：598－618.

［5］Fahey J W，Zalcmann A T，Talalay P.The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants［J］.Phytochemislry，2001，56（1）：5－51.

［6］Fenwick G R，Heaney R K，Mullin W J.Glucosinolates and their breakdown products in food and food plants［J］.Crit Rev Food Sci Nutri，1983，18（2）：123－201.

［7］阮颖，周朴华，刘春林.植物硫代葡萄糖苷－黑芥子酶底物酶系统［J］.湖南农业大学学报，2007，33（1）：18－23.

［8］Halkier B A，Gershenzon J.Biology and biochemistry of glucosinolates［J］.Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：303－333.

［9］徐文佳，陈亚州，阎秀峰.芥子油苷－黑芥子酶系统及其在植物防御和生长发育中的作用［J］.植物生理学通讯，2008，44（6）：1189－1196.

［10］Giamoustaris A，Mithen R.The effect of modifying the glucosinolate content of leaves of oilseed rape（Brassica Napus ssp.oleifera）on its interaction with specialist and generalist pests［J］.Ann Appl Biol，1995，126（2）：347－363.

［11］Lambrix V，Reichelt M，Mitehell－Olds T，et al.The arabidopsis epithiospecifier protein promotes the hydrolysis of glucosinolates to nitriles and influences trichoplusia ni herbivory［J］.Plant Cell，2001，13（12）：2793－2807.

［12］高泽正，吴伟坚，崔志新.硫代葡萄糖苷对黄曲条跳甲寄主选择性的影响［J］.华南农业大学学报，2001，22（4）：40－42.

［13］喻国泉，吴胜伟，吴建雄，等.植物中硫代葡萄糖苷对小菜蛾产卵的影响［J］.华南农业大学学报，1998，19（2）：13－19.

［14］Ratzka A，Vogel H，Kliebestein D J，et al.Disarming the mustard oil bomb［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（17）：11223－11228.

［15］Wittstock U，Agerbirk N，Stauber E J，et al.Successful herbivore attack due to metabolic diversion of a plant chemical defense［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（14）：4859－4864.

［16］Bridges M，Jones A M，Bones A M，et al.Sparial organization of the glucosinolate－myrosinase system in brassica specialist aphids is similar to that of the host［J］.Plant Proc Biol Sci，2002，269（1487）：187－191.

［17］Mewis I，Tbbkuhisa J G，Schultz J C，et al.Gene expression and glucosinolate accumulation in arabidopsis thaliana in response to generalist and specialist herbivores of different feeding guilds and the role of defense signaling pathways［J］.Phytochemistry，2006，67（22）：2450－2462.

［18］De－la－Pena C，Badri D V，Lei Z，et al.Root secretion of defense－related proteins is development－dependent and correlated with flowering time［J］.J Biol Chem，2010，285（40）：30654－30665.

［19］Nakamura Y，Iwahashi T，Tanaka A，et al.4－（Methylthio）－3－butenyl isothiocyanate，a principal antimutagen in daikon（Raphanus sativus；Japanese white radish）［J］.J Agric Food Chem，2001，49（12）：5755－5760.

［20］Stephen S H.Chemoprevention of cancer by isothiocyanate，modifers of carcinogen metabolism［J］.Journal of Nulrition，1999，129（3）：768－744.

［21］沈奇，汪隆植.萝卜肉质根辣味定量分析［J］.园艺学报，1996，23（3）：251－254.

［22］Carlson D G，Dasenbichler M E，Vanetten C H，et al.Glucosinolates in radish cultivars［J］.J Amer Soc Hort Sci，1985，110（5）：634－638.

［23］Okano K，Asano J，Ishii G.A rapid method for determining the pungent principle in root of Japanese radish（Raphanus sativ us L）［J］.J Japan Soc Hort Sci，1990，59（3）：545－550.

［24］刘光文，何启伟.潍县萝卜优良品质与环境因素关系的研究［J］.中国蔬菜，1982，（2）：1－4.

［25］汪隆植，何启伟.中国萝卜［M］.上海：科学技术文献出版社，2004.

［26］Maria F A，Pereira V，Rosa E.Influence of temperature and ontogeny on the levels of glucosinolates in Broccoli（Brassica oleracea varitalica）sprouts and their effection the induction of mammalian phase 2 enzymes［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（21）：6240－6244.

［27］Tripathi M K，Mishra A S.Glucosinolates in animal nutrition：A review［J］.Animal Feed Science and Technology，2007，132（1／2）：1－27.

［28］Antonious G F，Kasperbauer M J，Byers M E.Light reflected from coloredmulches to growing turnip leaves affects glucosinolate and sugar contents of edible roots［J］.Photochemistry and Photobiology，1996，64（3）：605－610.

［29］Andersson D，Chakrabarty R，Bejai S，et al.Myrosinases from root and leaves of arabidopsis thaliana have different catalytic properties［J］.Phytochemistry，2009，70（11／12）：1345－1354.

［30］Nong H，Zhang J M，Li D Q，et al.Characterization of a novelβ－thioglucosidase Cp TGG1 in Carica papaya and its substrate－dependent and ascorbic acid－independent O－β－glucosidase activity［J］.J Integr Plant Biol，2010，52（10）：879－890.

［31］Hara M，Fujii Y，Sasada Y，et al.CDNA cloning of radish（Raphanus sativus）myrosinase and tissue－specific expression in root［J］.Plant Cell Physiol，2000，41（10）：1102－1109.

［32］Pang Q，Chen S，Li L，et al.Characterization of glucosinolate－myrosinase system in developing salt cress the llungiella halophila［J］.Physiol Plant，2009，136（1）：1－9.

［33］Bones A M，Rossiter J T.The enzymic and chemically induced decomposition of glucosinolates［J］.Phytochemistry，2006，67（11）：1053－1067.

［34］Rask L.Andreasson E，Ekbom B，et al.Myrosinase：gene family evolution and herbivore defense in brassieaceae［J］.Plant Mol Biol，2000，42（1）：93－113.

［35］Borgen B H，Thangstad OP，Ahuja I，et al.Removing the mustard oil bomb from seeds：transgenic ablation of myrosin cells in oilseed rape（Brassica napus）produces MINELESS seeds［J］.J Exp Bot，2010，61（6）：1683－1697.

（责任编辑：肖恩忠）

The Piquancy of Radish and Myrosinase

LIU Chun－xiang，LI Hong－tao，ZHAO Guang－qiang
（Weifang University，Weifang 261061，China）

This paper reviewed some factors related to the puiquancy of radish.The chemical component，characters，varieties and of radish piquancy compounds were introduced，and also environmental factors effecting the formation of radish piquancy compounds were mentioned.The function of the puiquancy compounds include plant defences function and others，the physiological function for human were briefly summarized.The study of myrosinase and myrosinase gene were introduced in detail.We describe the prospect of myrosinase gene and the regulation of radish piquancy.

radish，piquancy，myrosinase

2011－05－16

山东省星火计划项目（2010XH0620）；山东省教育厅项目（J09LC53）；潍坊市科技发展项目（201003038）

刘春香（1974－），女，黑龙江望奎人，潍坊学院生物工程学院副教授，博士。研究方向：蔬菜育种与分子生物学。

S631.1 文献标识码：A 文章编号：1671－4288（2011）06－0077－05