乳酸菌重组表达抗菌肽研究进展

东北农业大学动物营养研究所 许文杉 冯兴军＊

抗生素的不合理应用及滥用，使得耐药性问题日益突出。近年来，耐药菌株以及细菌耐药造成的后果也日趋严重。因此，寻求新型抗菌药物的任务就变得尤为迫切。抗菌肽因其广谱高效抗菌活性及独特的抗菌机制而在新型抗菌药物研究中显露出明显优势。

乳酸菌能够产生一些抑菌或杀菌物质，如乳酸链菌肽（nisin）就是乳链球菌代谢产生的抗菌物质（小分子抗菌肽），已被世界上50多个国家和地区应用为食品的天然防腐剂 （Beisswenger和Bals，2005；Kim 和 Broden，2005）。 随着基因工程技术的发展，乳酸菌作为一种新型的重组表达系统，具有巨大的应用与发展前景。乳酸菌不产生内毒素，表达的外源蛋白无需经过纯化可以直接连同菌体一起服用，利用乳酸菌作为表达载体制成口服疫苗已有不少报道（Gaczynska等，2003）。抗菌肽分离纯化困难且成本较高，导致其临床应用受到很大限制，寻找合理有效且能够方便应用的方法成为解决抗菌肽应用受限的关键问题。近年来，乳酸菌重组表达抗菌肽展现出独特的优势。本文就抗菌肽在乳酸菌中重组表达研究进展进行综述。

1 乳酸菌表达系统

1.1 LAB表达系统的表达载体 乳酸菌作为表达抗菌肽的宿主菌，除了必须得到适合基因操作的菌株外，还必须建立合适的载体。用于LAB表达系统的表达载体一般包括以下几个基本组成部分：启动子、用于筛选的标记基因、复制子、多个用于外源基因插入的内切酶位点。从目前的报道来看，表达载体通常使用诱导型的启动子（Andrea等，2000）， 主要有 lacA∕lacR，nisA∕nisZ，trpE，pal70等，其中前三种来源于L.lactis，pal70属于诱导型启动子低温或低pH值启动表达。使用nisA∕nisZ启动子的乳酸菌表达系统表达过多种外源基因（Wegmann等，2007），是最常用的表达系统之一，诱导物Nisin是安全、无毒害的，诱导作用与诱导物乳链菌肽的浓度在一定范围内成正比（王海英和祁克宗，2007）。启动子来自于抗菌肽的基因属食品级。许多带nisA/nisZ启动子的表达载体上不再用抗生素抗性筛选标记，而是用一些食品级的筛选标记，如lacF。研究表明，利用乳酸菌基因组探索乳酸菌的抗菌潜力及其作为生物防腐剂在食品保藏中有很大的应用前景 （易华西和张兰威，2009）。目前，在乳酸乳球菌中发现了受pH值调节的启动子（p170），对其进行缺失突变发现p170的pH诱导作用提高了 150倍（Madsen等，1999）。

1.2 筛选标记 对于筛选标记基因，过去常用的表达载体一般以抗生素抗性基因作筛选标记，使用最多的是Cmr、Amp两种基因。由于这类标记基因对抗生素具有抗性，并且在转化过程中需要使用一定的抗生素进行筛选，因此带来了一些安全性问题。新开发的载体，主要采用对人体无害的非抗生素抗性基因作选择标记。现在用于乳酸杆菌表达系统的食品级选择性标记主要有三类：糖类利用标记、营养缺陷型标记、编码细菌素抗性。如此，构建出的乳酸杆菌表达系统、载体、受体及诱导物均达到食品级，可直接制成口服制剂。当启动子的诱导物也为食品级时，表达载体可与相应的LAB宿主菌一起构成一个食品级表达系统。

1.3 信号肽 由于乳酸杆菌可分泌大量的S－层蛋白，因此可以选择利用S－层蛋白的高效表达信号，携带外源基因进行分泌表达。作为同一种属的乳酸杆菌的S－层蛋白信号肽基因的同源性极高，可以将一种具有更强分泌作用的乳酸杆菌的信号肽应用到另一种乳酸杆菌表达系统中，以期获得高效分泌。但要考虑信号肽切割位点前后的几个氨基酸，因为这关系到外源蛋白分泌后信号肽能否正确切除（陈德富和陈喜文，2006），因此通过克隆乳酸杆菌S－层信号肽基因，就可为进一步构建乳酸杆菌的分泌表达系统奠定基础，也为构建分泌表达外源抗原的基因工程乳酸杆菌提供基本素材。

将目的基因序列引入信号肽基因序列下游，使其与自然存在的分泌蛋白质结构相符，就可以构建分泌型表达载体。但同时要注意以下几点：第一，信号肽的选择及信号肽序列的改造。在构建载体时加入新的信号肽有可能提高外源蛋白分泌，如果对信号肽本身进行适当改造，将会显著提高外源蛋白的表达量。第二，信号肽切割不完全现象。这会使所分泌的蛋白质带有多余的氨基酸残基，因此必须消除信号肽切除不完全现象，才能获得与天然蛋白质一致的氨基酸序列。第三，信号肽酶的酶切效率。研究表明，用HindⅢ酶切去掉pZLBe7中的β-内酰胺酶基因片段，构建成乳酸菌分泌型表达载体，用此载体在乳酸菌中表达和分泌一些有价值的外源基因，以研究乳酸菌中基因产物表达和分泌的机制 （陈秀株和刘宗旨，2001）。

2 抗菌肽在乳酸菌中的重组表达

作为乳酸菌的模式菌，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的完整基因组测序已经完成，为乳酸菌基因工程的发展和表达载体的构建奠定了基础。进一步的研究阐明了乳酸菌染色体及与质粒有关的基因结构和功能，并完整地绘制出L.lactis和植物乳杆菌 （Lb.plantarum）的基因组图谱（Mathiesen等，2004）。由于LAB的染色体基因组小，而且许多功能性物质是由其染色体外质粒上的基因所编码的，所以经改造后去除了质粒的菌株几乎不分泌任何本源蛋白，非常适合用于外源基因的表达（Christiaens等，1992）。目前国内外研究者已经成功克隆了一些抗菌肽的基因和cDNA，并已在大肠杆菌、家蚕细胞、粉纹夜蛾末龄幼虫和天蚕滞育蛹、Sf21细胞以及酵母细胞等原核或真核体系中得以克隆表达，扩大了抗菌肽基因的资源。研究证实，将L.lactis用于大规模基因表达，并代替E.coli成为外源蛋白质表达的宿主菌具有诸多优势（Mierau等，2005）。主要体现在两方面：（1）乳酸乳球菌的胞外蛋白酶很少，当以胞外蛋白酶含量少的菌株作为宿主菌时，通过信号肽介导的胞外的分泌表达可以一定程度上消除胞内蛋白酶对抗菌肽的降解，而增加目标肽的稳定性和产量。比较而言，大肠杆菌和酵母作为宿主都含有一定的胞外蛋白酶，而抗菌肽所携带的碱性氨基酸使其对这些蛋白酶很敏感，表达的抗菌肽在表达细胞中也容易被降解。试验证明，通过双质粒的引入，其中的一个质粒含有Lactococcin A的分泌表达相关基因 （lcncD），成功地在产nisin的乳酸乳球菌中分泌表达了抗菌肽Laetoeoeein A，实现了nisin和LaetoeoeeinA的高水平共表达，避免了乳酸乳球菌胞内蛋白酶的降解，同时有利于蛋白的纯化过程 （Fernandez等，2004）。而且，乳酸菌是安全级微生物，可以口服，免去一般基因工程菌所需的繁琐提取工艺，为基因工程生产廉价、安全的生物制品开辟了新途径。（2）乳酸菌具有强烈的、高度可调控的启动子系统，可表达毒素基因，在细胞内和细胞表面均可表达，并分泌到胞外培养基中。通过对api-daecin的结构进行分析，构建了乳酸乳球菌分泌表达载体，实现了apidaecin在乳酸乳球菌中的分泌表达（周绪霞，2008）。乳酸菌与其他细菌比较，其蛋白质水解能力较弱，这对外源蛋白的表达极为有利。研究发现，乳酸杆菌对维持微生态平衡具有重要作用，具有控制肠道感染、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗突变和抗辐射作用，还可以减缓乳糖不耐症等功效（刘小青等，2009）。

3 存在的问题

乳酸菌作为表达功能性蛋白和外源抗原的条件相对成熟，然而，利用乳酸菌表达抗菌肽仍面临一些问题：（1）遗传背景相对薄弱。大肠杆菌表达是现今掌握最为成熟的表达系统，目前运用大肠杆菌进行的抗菌肽基因工程研究是主要方式。关于乳酸菌遗传背景的认识相对前者还较薄弱。（2）表达效率不稳定。研究显示，经nisin诱导表达的阳性单克隆用超声波破碎，取细胞裂解后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，与标准分子质量Marker比较显示4.5 kD未见到目的条带。这主要是因为乳酸菌表达系统在表达外源基因蛋白时表达量比较少造成的（杨涛，2009）。（3）信号肽分泌效率不稳定。信号肽对不同的异源蛋白分泌效率有很大的差异，信号肽的分泌效率受胞内外源蛋白mRNA水平、微生物培养及诱导条件的影响（Bron等，2004）。尽管乳酸菌基因表达系统可以使蛋白质高效表达，但是仍有许多蛋白质表达量低、纯度不高、活性差，严重影响外源蛋白的生产，因此真正推向市场的高效产品并不多。利用一些特定的信号序列，使某些蛋白质分泌或正确定位，可为一些以特定细胞器为靶点的新药研制提供新途径，在一定水平上将使细胞有序地成为基因治疗的入手点。

4 展望

随着基因工程技术的不断发展，乳酸菌表达系统也得到了进一步开发和应用。目前，已通过食品级乳酸菌基因表达系统表达出丙氨酸消旋酶、真核生物蛋白质、活菌疫苗等生物制品。乳酸菌食品级基因表达系统的研究和应用具有相当大的潜力，随着科学研究及认识的不断深入，设计合成新型抗菌肽的基因，建立高效的乳酸菌表达体系和廉价、快速的纯化系统，对于抗菌肽应用于畜牧业、实现畜牧业持续健康发展具有重要意义。

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