天山堇菜挥发油提取时间及抗炎作用研究

杨 瑾，阳 辉，陈龙全，沈正龙

湖北民族学院医学院(湖北恩施，445000)

天山堇菜Viola tianshanica Maxim.为堇菜科Violaceae堇菜属植物，多年生草本，以全草入药［1］。Binafuxi为天山堇菜的维吾尔医习用名称，有调理、软化、发汗的作用，主要用于各种发烧、受寒、感冒、咽炎、疔疮肿痈等症，在新疆和田地区民间广泛应用。《维吾尔药志》记载，天山堇菜“微苦，辛，凉”，“清热解毒，主要用于感冒发热、疔疮中毒、淋巴肿大”［2］。天山堇菜的化学成分以及药理活性都少有文献报道，作者立足对天山堇菜乙醇提取物的体外抗肿瘤实验筛选，跟踪发现活性成分主要集中在低极性部分［3，4］。天山堇菜挥发油成分的GC－MS分析与抗菌活性之前有过报道，其提取工艺、抗炎作用目前还未见报道。作者对天山堇菜挥发油的提取时间进行了考察，并设计急性炎症模型对其抗炎作用进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 FZ－102微型植物样品粉碎机(上海安锐自动化仪表有限公司);SK3200HP超声仪(上海科导超声仪器有限公司);Sartorius电子分析天平;标准检验筛(20目，浙江省上虞市五四纱筛厂);挥发油提取器(北京玻璃仪器厂);DZTW电子调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);耳冲打耳器(8 mm)。所有试剂均为分析纯。

1.2 实验动物 SPF级BALB/c雄性小白鼠，体重20.0±2.0 g，由武汉大学动物实验中心提供。小白鼠喂养一周，观察有无异常反应或其它情况，健康正常的小鼠用于实验。

1.3 实验药材 天山堇菜(Viola tianshanica Maxim.)，新疆医科大学药学院热娜·卡斯木教授鉴定、提供。

1.4 实验方法

1.4.1 蒸馏时间对挥发油提取率的影响 按中国药典［5］2010版一部附录X D的方法(中华人民共和国卫生部药典委员会，2010)提取天山堇菜挥发油。称取天山堇菜粉末50 g，粉碎，过20目筛，预实验结果表明［6，7］，天山堇菜粉末与蒸馏水比例为 1∶7时，药材粉末可被完全浸没，考虑到药材粉末浸泡膨胀以及提取中水蒸气的损耗，因此将天山堇菜粉末与蒸馏水的比例调整为1∶10。

将天山堇粉末置于1000 ml圆底烧瓶中，加入500 ml水和少许玻璃珠，摇匀，电热套缓慢加热，分别考察提取时间为 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 等时点挥发油的得率。用乙醚萃取3次油状液体，减压回收乙醚，无水硫酸钠干燥后过滤，得淡黄色油液。

天山堇菜挥发油在干燥至恒重后，称重计算出油率。其出油率按下式计算:

其中，Y:出油率;W1:提取天山堇菜挥发油质量(g);W2:天山堇菜粉末质量(g)。

1.4.2 抗炎作用实验 根据炎症发展过程中不同时期的病理特点，实验炎症模型主要分为三类:以血管通透性增强，白细胞游走和炎症介质释放为主要改变的各种早期炎症模型;以免疫活性细胞激活为主要特征的中期炎症模型;以血管及组织增生为主要特征的各种晚期炎症模型。天山堇菜挥发油抗炎作用的考察选用了急性炎症模型，即二甲苯致小鼠耳肿胀［8，9］。该实验以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征，反应药物对炎症早期血管通透性增加的影响程度。

取预实验合格的小鼠40只，体重18～22 g，随机分成4组，每组10只，空白对照组(生理盐水)、低剂量组(0.1 ml/kg)、高剂量组(0.2 ml/kg)、阳性对照组(阿司匹林10 mg)。空白对照组、低剂量组和高剂量组的小鼠进行灌胃(ig)，每日1次，连续3 d;阳性对照组于实验当天腹腔注射(ip)。末次给药30 min后，于小鼠右耳两面均匀涂抹20 μl二甲苯致炎，左耳作为对照，致炎后30 min处死动物，剪下两耳用8mm打孔器分别在同一位置打下圆耳片，电子天平精密称重，以左右耳片重量之差为肿胀度，计算肿胀抑制百分率:

挥发油提取法有有机溶剂提取法、水蒸馏法、超临界萃取法等。水蒸馏法节省溶剂，无污染、成本低，便于操作，故实验采用此方法作为天山堇菜中挥发油的提取方法。实验证明，其蒸馏时间确定为6 h，挥发油得率可达0.76%。

2 结果

2.1 天山堇菜挥发油提取的最佳时间 蒸馏初始时，天山堇菜挥发油快速与水蒸气形成共沸，快速蒸发出来，持续到4 h。此后挥发速度有所减慢，90%左右的天山堇菜挥发油5 h以内已经提取出来，药渣中挥发油类成分减少，油水比例相应减低，共沸点升高，挥发油馏出的量迅速减少。水蒸气蒸馏6 h，95%左右的挥发油被提取出来，继续蒸馏，挥发油的量增加逐渐呈负数。考虑到长时间加热，可能会使已经提取出来的挥发油再次挥发损耗，因此天山堇菜挥发油的蒸馏时间确定为6 h，天山堇菜挥发油得率为0.76%(以天山堇菜药材干品重量计)。见图1。

图1 天山堇菜挥发油水蒸气提取率测定

2.2 天山堇菜挥发油对小鼠耳肿胀度的抑制 从表1 可见，挥发油剂量为0.1ml/kg、0.2ml/kg 时，肿胀抑制率为24.62%、37.13%，与生理盐水的空白对照组比较有显著性差异，表明天山堇菜挥发油对炎症具有一定的抵抗作用，呈现剂量相关性。

表1 天山堇菜挥发油对二甲苯所致小鼠耳肿胀度的影响(n=10)

3 讨论

挥发油提取法有有机溶剂法、蒸馏法、萃取法等。蒸馏法节省溶剂，无污染，成本低，便于操作，故我们采用此方法提取天山堇菜中的挥发油。实验结果证明，其最适蒸馏的时间为6 h，挥发油得率可达0.76%。炎症是由炎症细胞及其释放的炎症介质参与引起的一系列病理生理过程。炎症反应可引起毛细血管扩张，通透性增加，中性粒细胞趋化、游走至炎症反应灶，释放炎症介质，并产生O·－2等活性氧自由基。由于炎性渗出引起组织水肿，会导致炎症局部形态膨胀、体积增大，还会使发炎器官的重量增加［10～13］。

给小鼠的耳廓涂抹二甲苯引起耳廓肿胀，采用重量法测定耳廓肿胀程度，结果灌服天山堇菜挥发油的小鼠耳片的增重值显著小于空白组，可见天山堇菜挥发油对早期、急性炎症具有确切的抑制作用。这也许是天山堇菜能治疗发烧、受寒、感冒、咽炎、疔疮肿痈的物质基础之一。中草药的抗炎作用机制十分复杂，难以具体分类。一种中草药的不同活性成分往往具有不同的作用机制;有时即使是同一成分，其作用机制也可因机体的免疫状态的不同而不同。中草药是天然产物，一种中草药包含多种活性成分，并且存在一种中草药中的多种活性成分均有抗炎作用的现象。对于这些活性成分是否在抗炎过程中起协同作用，相互之间的作用是如何进行的并不十分清楚，尚需进一步采用新技术、新方法进行深入研究。下一步我们将对天山堇菜挥发油的化学成分进一步分离和纯化，为其抗炎作用的物质基础和作用机理提供科学依据。在以后的工作中我们将在其进行活性指导下，对天山堇菜挥发油的化学成分进一步分离和纯化，为抗炎作用的物质基础和作用机理提供科学依据。而天山堇菜非挥发性化学成分及其药理活性还有待进一步的研究。

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