甲氧苄啶与中药复方联用抗菌增效作用的研究

王 新，崔一 ，邵 红，韩铁锁

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

中药抗菌作用的研究是在中药治疗感染性疾病确有疗效的基础上进行的[1]。由于抗生素的广泛应用，曾使中药抗菌作用的研究不被医学界所重视。但细菌耐药性的普遍产生和日益被关注的药物残留问题，为中药抗菌作用的研究提供了契机。关于中药抗菌作用的研究资料较多，其中单味中药抗菌作用的研究资料明显多于中药复方[2]，这与中药多是复方应用的客观现状不符。加强中药复方抗菌作用的研究才符合临床应用的需求。甲氧苄啶为化学合成的抗菌增效剂，对多种抗生素和中药具有抗菌增效作用[3－4]。目前，关于甲氧苄啶对中药抗菌增效作用的研究较少，且仅为定性研究。因此定量研究甲氧苄啶对中药抗菌增效作用，为研发防治畜禽疾病的中西药复方制剂奠定了坚实的基础，对有效地控制畜禽细菌性疾病和促进中药在兽医临床上的广泛应用，具有重要的理论意义和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

沙门氏菌（CMCC50115）、大肠杆菌（ATCC35218）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）均购于中国兽医药品监检所。

1.1.2 药物

甲氧苄啶购于太原市康瑞宝兽药制造有限公司，批号：20080503。黄芩、连翘、板蓝根和蒲公英4味中药购于大庆市福瑞邦医药公司。

1.2 方法

1.2.1 药物溶液的制备

精确称量128 mg的甲氧苄啶制成1 280 μg·mL－1的甲氧苄啶药液100 mL。采用水提醇沉法制备含2 g·mL－1生药的中药提取液，将黄芩、板蓝根、蒲公英和连翘的提取液按1∶1∶2∶1比例配伍组成中药复方（含生药量为625 mg·mL－1），流通蒸汽灭菌30 min，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌种活化

采用常规方法进行细菌活化，将菌液稀释至浊度为1×107cfu·mL－1，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 中药复方和甲氧苄啶的体外抗菌试验

采用试管二倍稀释法[5]测定甲氧苄啶及中药复方对3种细菌的最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.4 中药复方与甲氧苄啶联用体外抗菌增效试验

将中药复方用无菌肉汤稀释到2 MIC浓度，将甲氧苄啶药液稀释到640、320、160、80和40 μg·mL－1浓度。取7只已编号灭菌试管，1～5号管分别加入5种甲氧苄啶药液1 mL和2 MIC的中药复方1 mL，6号管中加入2 MIC的中药复方和肉汤各1 mL，7号管为对照管加入肉汤2 mL；然后每个试管中加入2×106cfu·mL－1细菌悬液0.1 mL。充分摇匀后，4℃冰箱内静置。分别在1、2、4和8 h，采用平板计数的方法测定细菌数[6]，并计算杀菌率。其计算公式为：杀菌率（%）=（对照管菌落数－试验管菌落数）/对照管菌落数×100%。试验重复3次。

1.2.5 数据处理

采用SPSS软件中ANOVA程序进行数据统计学分析。

2 结果与分析

2.1 中药复方和甲氧苄啶的体外抗菌试验

从表1可知，甲氧苄啶对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗菌活性较强，而中药复方对金黄色葡萄球菌抗菌活性较强，对沙门氏菌和大肠杆菌相对较差。

表1 药物对3种细菌的MIC值Table 1 MIC of drugs on three kinds of bacteria

2.2 中药复方与甲氧苄啶联用体外抗菌增效试验

试验结果见表2～4。从表中可知，当甲氧苄啶添加剂量为 40 μg·mL－1时，表现出显著的抗菌增效作用（P＜0.01），且随着剂量的升高而增强。但甲氧苄啶的添加剂量为160与320 μg·mL－1两组比较差异性不显著（P＞0.05），表明甲氧苄啶的添加剂量与其对中药复方抗菌增效作用之间的存在一定的线性关系，并不是TMP的添加剂量越大越好，而是存在一个最优的添加剂量。此外，还发现甲氧苄啶与中药复方联用的最佳添加量依据菌种的不同也存在较大的差异。利用最小二乘法对各表的1、2、4和8 h杀菌率进行拟合，均符合一元二次方程y=ax2+bx+c，拟合度均达到0.95以上；然后依据公式ymax=－b/2a计算甲氧苄啶添加的最优值。计算出对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌甲氧苄啶添加的平均最优值分别为224、244和252 μg·mL－1。将甲氧苄啶添加的平均值与中药复方用量（金黄色葡萄球菌为78 mg·mL－1，大肠杆菌和沙门氏菌为156 mg·mL－1）进行换算，得到甲氧苄啶对中药复方体外抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌最优添加剂量分别为2.9、1.6和1.6 mg·g－1。

表2 药物联用对金黄色葡萄球菌的杀菌率(±S,%)Table 2 Bactericidal rate of drugs combination against Staphylococcus aureus（μg·mL-1）

表2 药物联用对金黄色葡萄球菌的杀菌率(±S,%)Table 2 Bactericidal rate of drugs combination against Staphylococcus aureus（μg·mL-1）

注：同行间比较，不同字母间相比较差异显著（P＜0.05），含相同字母者为差异不显著（P＞0.05）；下同。Note:Comparison between the same line,different letters mean significant difference(P＜0.05)，same letter means insignificant difference(P＞0.05).The same as below.

时间（h）Time甲氧苄啶添加量Trimethoprim dosage 0 204080160320 45.06±1.24a 56.45±1.55a 65.88±2.15a 80.94±1.32a 1 2 4 8 48.88±1.56ba 59.93±1.64ba 68.68±2.00a 82.14±2.66ba 51.31±2.28b 63.08±2.60bc 74.88±1.52b 85.77±2.32b 56.02±1.59c 67.66±2.05cd 80.43±3.07c 90.16±2.05c 59.39±0.83cd 70.24±2.26d 84.06±3.74cd 92.98±2.52c 62.43±1.22d 71.28±2.14d 85.95±2.16d 93.30±1.59c

表3 药物联用对大肠杆菌的杀菌率(±S,%)Table 3 Bactericidal rate of drugs combination against Escherichia coli（μg·mL-1）

表3 药物联用对大肠杆菌的杀菌率(±S,%)Table 3 Bactericidal rate of drugs combination against Escherichia coli（μg·mL-1）

时间（h）Time甲氧苄啶添加量Trimethoprim dosage 0 204080160320 37.75±1.56a 51.54±0.80a 62.29±1.55a 74.10±1.19a 1 2 4 8 41.91±1.69a 53.86±1.61a 65.85±2.39a 76.22±1.86a 46.06±1.45b 60.01±1.50b 70.58±2.89b 81.04±1.55b 52.86±0.89c 65.95±1.59c 76.38±1.97c 85.81±1.13b 56.98±1.59cd 70.80±1.23d 82.92±1.41d 90.70±1.44c 59.19±1.22d 71.57±0.83d 85.04±1.47d 94.06±0.90c

表4 药物联用对沙门氏菌的杀菌率Table 4 Bactericidal rate of drug combination against Salmonella (X±S,%)

3 讨论与结论

中药复方中黄芩为君药，以连翘、蒲公英为臣药，板蓝根清热解毒，与黄芩、连翘相呼应，共凑清热解毒、消肿散结之功效。试验结果表明,中药复方对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的MIC值分别为78、156和156 mg·mL－1。而张丁华等自拟6种中药复方对沙门氏菌的MIC为41.7～166.7 mg·mL－1，对大肠杆菌的 MIC 在 62.5～125 mg·mL－1之间[7]。卢芳国等报道 12种中药复方对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均在62.5～125 mg·mL－1之间[8]。抗菌活性的差异一方面是与中药复方的组成有关，另外也与细菌的毒力、接菌数量和试验方法等密切相关。

甲氧苄啶对中药增效作用的报道多是定性研究[9－10]，而甲氧苄啶与中药联用时的最佳添加剂量的研究更具有临床实际应用价值。本试验依据甲氧苄啶MIC值，设定了甲氧苄啶的系列添加剂量；采用了4℃静置的方式使药物作用于细菌，避免了37℃恒温培养时细菌呈几何基数增殖造成的用药组与对照组之间的不可比性；再利用最小二乘法对试验数据进行处理，从而提高了试验结果的准确性。结果表明甲氧苄啶对中药复方发挥了明显的抗菌增效作用，并计算出甲氧苄啶对中药复方体外抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌最优添加剂量，由于中药的体外抗菌机制尚未明确，所以二者联用增效的机理有待于进一步探讨。

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