凝胶过滤层析参数对EV71病毒粗提液分离效果的影响

杨永华，邵 强*，皮川真，杨全中，苏志国

（1.河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007；2.华兰生物工程有限公司，河南 新乡 453007；3.中国科学院过程工程研究所，北京 100190）

人肠道病毒7l型（EV71）是小RNA病毒科，人肠道病毒属的成员[1]，主要在肠道内进行复制[2]。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起,直径大约在24～30 nm，核酸为单股正链RNA。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者又是由四种衣壳蛋白VP1～VP4拼装成的五聚体样结构[1]。自1969年，第一株EV7l病毒从美国加利福尼亚州一名患有神经系统疾病的婴儿体内分离出来[3]。从此以后，EV71在全球范围内逐渐流行，从20世纪70年代主要在保加利亚，匈牙利等欧洲国家流行，直至20世纪90年代起，EV7l开始肆虐东南亚地区、日本、马来西亚、中国台湾、中国大陆等地均深受其害[4-9]。

EV71感染主要引起患者手足口病，在临床上与柯萨奇病毒A16（Coxsakie A16，CAl6）感染所引起的手足口病难以区别，儿童感染后部分出现多种与神经系统相关的严重并发症，包括神经源性肺水肿、脑干脑炎和心肌炎心衰等，神经源性肺水肿多在12 h内死亡率且病死率极高[1]。近年来，EV71病毒流行在亚太地区呈上升趋势[10-12]，2008年3月安徽阜阳暴发流行EV7l型相关性手足口病，随后东南沿海及内陆地区也相继暴发EV71手足口病[13]。EV71的爆发和流行已经引起各国政府和科研工作者的注意，如何对其进行有效的预防日益受到人们的重视。

凝胶过滤层析法又称凝胶过滤排阻层析或分子筛层析，是60年代初发起来的一种简便而有效的液相柱层色谱技术。利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质（凝胶）为填料，通过洗脱液的连续洗脱，使混合物种的各种物质按其分子大小不同得到分离。凝胶过滤层析所需设备简单、操作方便、分离迅速，不影响样品的生物活性等特点，广泛用于大分子物质的分离纯化，也应用于蛋白质去盐及分子量的测定。这种方法条件温和、简便、分离范围广、回收率高[14]。凝胶过滤层析对EV71病毒粗体液的最佳分离效果受许多因素的影响。本文探讨了洗脱流速、上样量、缓冲液的pH和盐浓度对EV71病毒粗体液分离效果的影响，为凝胶过滤层析分离人类肠道病毒的应用提供了可靠的试验数据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

试剂：标准蛋白（192 μg·mL-1）（Sigma）；氢氧化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠（天津科密欧化学试剂有限公司）；Tris（Angus chemical）；盐酸（洛阳昊华化学试剂有限公司）；氯化钠（中盐宏博集团云梦云虹制药有限公司）。

上柱样品：EV71培养原液。

层析缓冲液：

PB缓冲液1：20 mmol·L-1PB+100 mmol·L-1氯化钠，将pH分别调为7.0、7.5及8.0；

PB缓冲液2：20 mmol·L-1PB+1 mol·L-1氯化钠，将pH调为7.5；

Tris缓冲液：20 mmol·L-1Tris-HCl+100 mmol·L-1氯化钠，将pH分别调为8.5及9.0；

1.2 方法

1.2.1 洗脱流速对EV71病毒粗提液分离效果的影响

EV71病毒粗提液分别上样同一sepharose 4FF凝胶过滤柱（Φ2.6 cm×70 cm），用0.02 mol·L-1PBS缓冲液平衡至电导，280、260和330 nm吸光值和pH不再变化，加入相同体积的样品，分别以15、30、45、60和75 cm·h-1流速洗脱后，在线检测280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，检测每洗脱条件下的第一峰蛋白含量、滴度和效价。

1.2.2 样品上样量对EV71病毒粗提液分离效果的影响

用0.02 mol·L-1PBS缓冲液平衡至电导，280、260和330 nm吸光值和pH不再变化，加入不同体积的样品（即1%CV、2%CV、3%CV、4%CV、5%CV），不同体积的样品一次以以60 cm·h-1的流速用缓冲液进行连续洗脱，在线监测280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，检测每洗脱条件下的第一峰蛋白含量、滴度和效价。

1.2.3 缓冲液pH值对EV71病毒粗提液分离效果的影响

用不同pH缓冲液（pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）作为流动相来平衡sepharose 4FF使电导，280、260和330 nm吸光值和pH值不再变化，加入相同体积的样品，以60 cm·h-1的流速用缓冲液（不同pH缓冲液，即pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）进行连续洗脱，在线监测280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，检测每洗脱条件下的第一峰蛋白含量、滴度和效价。

1.2.4 盐浓度对EV71病毒粗体液分离效果的影响

分别用含0.1、 0.2、 0.3 mol·L-1NaCl和 0.4 mol·L-1NaCl PBS缓冲液（pH 7.5）平衡至电导，280、260和330 nm吸光值和pH不再变化，加入相同体积的样品，以60 cm·h-1的流速分别用含0.1、0.2、 0.3和 0.4 mol·L-1NaCl PBS缓冲液（pH 7.5）连续洗脱，在线监测280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，检测每洗脱条件下的第一峰蛋白含量、滴度和效价。

2 结果与分析

2.1 洗脱流速对EV71病毒粗提液分离效果的影响

EV71病毒粗提液分别上样同一sepharose 4FF凝胶过滤柱，分别以30、45、60和75 cm·h-1的流速洗脱后，洗脱曲线见图1。当分别以30、45、60和75 cm·h-1的速度洗脱时（见图1），都展现出3个明显的峰；当以60 cm·h-1的速度洗脱时，在前者的第1个峰后紧挨着又出现一个不明显的小峰，总共展现出4个峰。且仅就第1峰的峰形而言，以60 cm·h-1的速度洗脱时的分离效果更好一些。通过检测层析后所收集样品的效价和滴度值（见表1），也是以60 cm·h-1的流速洗脱时，所检测得到的值更好一些。可见在本实验所选择的5个洗脱流速中，以60 cm·h-1的流速对人类肠道病毒粗提液的分离效果较好。

图1 不同的流速对EV71病毒粗提液的分离效果Fig.1 Different velocity of EV71 virus coarse extraction separation effect of liquid

表1 层析不同的流速对人类肠道病毒第一峰所收集样品的效价和滴度值(n=4)Table 1 Chromatography different velocity of human intestinal virus that first submmit sample collection titer and drip degrees values(n=4)（cm·h-1）

2.2 样品上样量对EV71病毒粗提液分离效果的影响

EV71病毒粗体液经同一sepharose 4FF凝胶过滤层析柱，不同上样量，同一pH缓冲液连续洗脱后，洗脱曲线见图2。不同体积的上样量，所层析出来的峰型不同，上样量在一定范围内与第一峰是成线性关系的，但大达到一定量后，第一峰的值并不随上样量的增加而增高，而是增加峰的宽度。综合各项检测指标得出（见表2），样品上样量为5%CV时EV71病毒粗体液的分离效果较好。

图2 不同的上样量对EV71病毒粗提液的分离效果Fig.2 Different sample weight to EV71 virus on coarse extraction separation effect of liquid

表2 层析不同的上样量对EV71病毒第一峰所收集样品的效价和滴度值(n=4)Table 2 Chromatography different sample weight to EV71 virus on the first peak by sample collection titer and drip degrees values(n=4)

2.3 缓冲液pH对EV71病毒粗提液分离效果的影响

凝胶过滤层析EV71病毒粗体液时，pH对其影响很大，当pH过高或过低时，将导致EV71病毒变性。层析图谱各pH条件差异不大，但通过检测所收集第一峰的样品效价和滴度（见表3），比较得出pH为7.5时，EV71病毒粗提液的分离效果较好。

表3 不同pH值对EV71病毒第一峰所收集样品的效价和滴度值(n=4)Table 3 Pifferent hydrogenion concentration to EV71 virus on the first peak by sample collection titer and drip degrees values(n=4)

2.4 盐浓度对EV71病毒粗体液分离效果的影响

采用逐步提高平衡缓冲液中氯化钠的浓度尽可能使更多杂蛋白流穿出来，从而使EV71病毒比活更高。从层析图谱上看，不同盐离子浓度的层析峰形基本一致但就第一个峰（经前面试验所得本试验所要抗原所在的峰）而言缓冲液含0.1 mol·L-1NaCl时，其吸光值最高，经检测所收集第一峰的样品效价和滴度（见表4），从效价上看，0.1 mol·L-1NaCl最高，0.2 mol·L-1NaCl效价很低，其他的基本和空白对照一致，即没有检测到效价。从滴度上看，也是0.1 mol·L-1NaCl滴度最高，其他盐离子浓度下病变不高或没有病变。综合考虑当缓冲液含盐浓度为0.1 mol·L-1对EV71病毒粗提液的分离效果较好。

表4 层析不同盐离子浓度第一峰样品的效价和滴度值(n=4)Table 4 Chromatography different salt ions concentration first submmit samples titer and drip degrees values(n=4)

3 讨论与结论

由于凝胶过滤层析的分离机理尚未完全明了，其分离效果与洗脱流速之间的关系还没有一个定论，不同的试验结果分歧很大，甚至得出截然不同的结论[15]。究其原因可能是各种物质的理化性质各不相同，在分离过程中不可能与凝胶完全排阻，还存在其他作用影响其分离效果。本试验选择了30、45、60和75 cm·h-14个洗脱流速，且仅就第1峰的峰形而言，只有以60 cm·h-1的流速洗脱时，总体分离效果最理想，推测EV71病毒粗体液与凝胶间可能存在着如络合反应之类的非物理作用。通过检测层析后所收集样品的效价和滴度值，也是以60 cm·h-1的流速洗脱时，所检测得到的值更好一些。

样品上样量对EV71病毒粗提液分离效果的影响：EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30 nm[1]，远远大于病毒培养液中的杂蛋白分子。根据凝胶柱层析原理，病毒颗粒最先被洗脱下来，当样品上样量较小时，病毒与杂蛋白被彻底分开，即上样量在一定范围内与第一峰是成线性关系的，即随着上样量的增加峰值增高；但超过一定量后，第一峰的值并不随上样量的增加而增高，而是增加峰的宽度，这样可能造成第一峰和第二峰分离不开。

缓冲液pH和盐浓度对EV71病毒粗提液分离效果的影响：缓冲液pH和盐浓度对凝胶过滤层析的峰型影响不明显，但对生物制品的活性有较大的影响。EV71病毒的生物活性与pH和盐浓度有关，有最佳的生物环境。从我们的结果可以看出，它在pH为7.5，盐浓度为100 mmol·L-1最理想。

[1] 金奇.医学分子病毒学[M].北京:科学出版社,2001:606-613.

[2] Vata A.Enterovirus71:Epidemiological and clinical aspects[J].Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi,1979,83(1):115-116.

[3] Hagiwara A,Tagaya I,Yoneyama T.Epidemic of hand,foot and mouth disease associated with enterovirus 71 infection[J].Intervirology,1978,9(1):60-63.

[4] Chumakov M,Voroshilova M,Shindarov L,et al.Enterovirus 71 isolated from cases of epidemic poliomyelitis-like disease in Bulgaria[J].Arch Virol,1979,60(3-4):329-340.

[5] Hagiwara A,Tagaya I,Komatsu T.Seroepidemiology of entervirus71 among healthy children near Tokyo[J].Microbiol Immunol 1979,23(2):121-124.

[6] Gilbert G L,Dickson K E,Waters M J,et al.Outbreak of enterovirus 71 infection in Victoria,Australia,with a high incidence of neurologic involvement[J].Pediatr Infect Dis J,1988,7(7):484-488.

[7] da Silva E E,Fillipis A M,Schatzmayr H G,et al.Evidence of enterovirus 71 infections in Brazil[J].Mem Inst Oswaldo Cruz,1990,85(1):131-132.

[8] Alexander J P,Jr Baden L,Pallansch M A,et al.Enterovirus 71 infections and neurologic disease-United States,1977-1991[J].Infect Dis,1994,169(4):905-908.

[9] Fan Y,Lili R,Zhaohui X,et al.Enterovirus71 Outbreak in China,2008[J].Clin Microbiol,2009,5(19):85-90.

[10] Ishimaru Y.Outbreaks of hand-foot-and-mouth disease by enterovirus 71[J].Arch Dis Child,1980,55:583-588.

[11] Komatsu K.Outbreak of severe neurologic involvement associated with enterovirus 71 infection[J].Pediatr Neurol,1999,20:17-23.

[12] Ho M.An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J].New Engl J Med,1999,341(13):929-935.

[13] Zhou S L,Li L L,Yang H,et al.The complete genome sequencing of enterovirus 71 SHZHO3 strainisolated in China[J].Chinese Journal of Virology,2004,20(1):7-11.

[14] Yang G D,Jiang Y M,Zhou H B.The observation of separation effectson three kinds of gel-filtration chromatography media to separate the protein mixture[J].Journal of Harbin Medical,2002,36(3):242-243.

[15] Tong W Y,Yao S J,Zhu Z Q.Partial separation propeflies of human epidermal growth factor in gel chromatography[J].Journal of Chemical Industry and Engineering,2002,53(4):369-372.