家蚕核型多角体病毒orf79克隆及原核表达

郝碧芳，徐 昉 ，王 猛 ，沈兴家

（1.江苏科技大学蚕业研究所，江苏 镇江 212018；2.江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏 镇江 212018）

家蚕核多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）隶属于杆状病毒科核多角体病毒属，是专一寄生于家蚕的一种重要病原微生物，每年都给蚕业生产带来巨大损失。同其他杆状病毒一样，BmNPV的感染循环过程具有双向复制周期，产生两种病毒形式，一种为出芽型的病毒粒子（Budded virus,BV），介导病毒的水平传播，另一种是包涵体型病毒（Occlusion-derived virus,ODV），介导病毒的垂直传播[1]。ODV是杆状病毒在昆虫宿主之间传播所必需的，当家蚕吞下污染包涵体的饲料，包涵体在中肠碱性环境下裂解释放出ODV，病毒粒子穿过围食膜后与中肠上皮细胞微绒毛结合，以直接的膜融合方式侵入中肠上皮细胞[2]，释放出核衣壳，核衣壳被运送到中肠细胞的细胞核内开始复制、组装，在昆虫敏感组织中重复这一复制过程并产生ODV以及多角体，导致昆虫死亡。

杆状病毒的ODV与宿主中肠上皮细胞的融合是病毒入侵宿主的关键，迄今为止已经发现6种定位于ODV膜上的口服感染因子（Peros infectivityfactors，PIFs），它们是病毒在宿主中肠起始初次感染时必需的[3-5]。p74是最早被鉴定的口服感染因子，也被称为PIF0，PIF1，PIF2，PIF3，PIF4与ODV e-56也先后被证明是口服感染必需因子。其中 PIF-4（Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV ORF96）是Fang等在2009年发现了一个新的口服感染因子[6]，缺失了PIF-4的缺陷病毒在体外不影响BV的感染性以及DNA的复制，其感染性和野生病毒没有区别，但是口服感染测定显示其对幼虫没有感染性。BmNPV orf79是pif-4的同源基因，虽然T3株的序列已经报道，但其具体功能尚不清楚，而BmNPV口服感染因子的研究是开展家蚕病毒病防止的前提条件；目前的研究表明杆状病毒感染宿主是通过感染复合体来完成的[7]，但是BmNPV的相关研究尚未报道，所以利用pull-down技术，以可溶性的病毒蛋白开展与宿主因子以及病毒其他因子的互作研究具有重要意义。

本研究从BmBacJS13[8]中克隆并测定orf79基因序列，对其进行生物信息学分析，利用原核表达系统开展ORF79的表达条件的探索，并利用亲和层析技术获得纯化的蛋白，为深入开展orf79在BmNPV感染中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BmBacJS13、DH10B、BL21菌株由本所重点实验室保存，Pyrobest聚合酶为TaKaRa产品，IPTG、碱性磷酸酶标记的羊抗兔的IgG、还原型谷胱甘肽购自Promega公司，引物合成及测序由上海生工生物工程公司完成，Sepharose 4B GST亲和材料以及其他常规试剂购自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 Orf79基因的PCR扩增及序列分析

根据BmNPV T3株（L33180）orf79基因的序列，设计引物：79F（5'GGCATGTTGTCAATCA TTTTGGCTAT3'）、A79R（5'GCGCTCGAGTTAATA AACTTGGTCTGTAGATGA 3'，下划线示Xho I酶切位点），以BmBacJS13 DNA为模板，PCR扩增基因片段。将该基因片段克隆至原核表达载体pMD18，并进行测序。在NCBI的中进行同源序列搜索，利用www.proteinprediction.com进行二级结构预测分析，并用ClustalX对杆状病毒同源基因进行序列分析，MEGA3.0进行进化分析，采用NJ法构建系统进化树。

1.2.2 原核表达载体构建及融合蛋白诱导表达

利用缺失0rf79 N端跨膜域（22氨基酸）的引物A79F（5'GGCGGATCCAAAAATCACCATCCATTTT TAC 3'，下划线示BamHⅠ酶切位点）与A79R扩增orf79，克隆至pGEX-6p-1表达载体。双酶切鉴定pGEX-6p-79阳性克隆子，并将其转化入大肠杆菌BL21中，挑取阳性单菌落接种于3 mL LB培养基中，37°C震荡培养过夜。取过夜培养物按照1：100比例接种于5 mL新鲜LB培养基中，14°C震荡培养至OD600nm为0.6，分别以不同终浓度IPTG诱导（浓度分别为：0.4、0.2、0.1和 0.05 mmol·L-1），14°C继续培养，筛选最优诱导浓度。以选择的最优IPTG浓度诱导，分别在诱导后1、2和4 h取1 mL培养物，离心收集菌体，重悬于500 μL PBS缓冲液中，超声波破碎，12 000 r·min-1离心，上清用于SDS-PAGE分析。

1.2.3 融合蛋白的纯化及Western blot检测

取过夜培养菌液按照1∶100转接500 mL培养基中，IPTG诱导2 h后5 000 r·min-1离心15 min收集菌体，PBS洗涤菌体3遍，每10 mL原培养液菌体洗涤后重悬于1 mL PBS中，超声波破碎菌体至不再黏稠。超声裂解液经12 000 r·min-1离心15 min，取上清用于亲和层析。将上清缓缓加入到含有4 mL Sepharose 4B的纯化柱中，流速为1 mL·min-1，待所有上清结合完后，用PBS（4°C，pH 7.4）清洗纯化柱（10 mL×5次），然后用还原型谷胱甘肽（10 mmol·L-1,pH 8.0）4 mL孵育10 min再洗脱，洗脱液用于SDS-PAGE分析。

将蛋白样品进行12%SDS-PAGE。电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中4°C封闭过夜，TBS-T缓冲液（50 mmol·L-1Tris-Cl,200 mmol·L-1NaCl,0.1%Tween 20,pH 7.5）室温洗膜10 min。GST多克隆抗体用0.5%脱脂牛奶稀释2 000倍，将膜浸入抗体稀释液中，37°C温育1 h。TBS-T缓冲液洗膜3次，每次10 min。二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔的IgG，用0.5%脱脂牛奶稀释5 000倍，将膜浸入二抗中，37°C温育1 h，TBS-T缓冲液洗膜3次，每次10 min，用NBT与BCIP显色。

2 结果与分析

2.1 Orf79序列分析

测序结果表明BmNPV陕西株的orf79与已报道的T3株完全相同，在组I NPV、组II NPV以及GV中都是保守的一个基因，N端以及C端各有一个跨膜域结构，其中N端序列具有一定的多态性，而中间序列以及C端序列高度保守，所以推测其中间高度保守的序列可能是其功能域。如图1所示，从进化树可以看出，BmNPV与组I其他病毒同源性很高，但是ORF79在C端跨膜域后部多出2个β-sheet结构的序列；orf79虽然与GV同源性最低，但是关键的功能域序列及C端跨膜域则是非常保守的，从而表明orf79功能的保守性。

图1 部分杆状病毒orf79同源序列的进化树分析Fig.1 Phylogenetic analysisof Baculovirus homologous gene of orf79

2.2 orf79基因的PCR扩增及原核表达载体鉴定.

结果见图2。

图2 Orf79基因原核表达载体Bam H I和Xho I酶切鉴定Fig.2 Determination of procaryotic expression vector by Bam H I and Xho I

由图2可知，将扩增的orf79基因用双酶切处理后连接到pGEX-6p-1载体上，经PCR（图略）和酶切鉴定均正确，大小约为500 bp左右，测序结果显示与GenBank中的orf79蛋白基因序列完全相同。

2.3 融合蛋白的优化表达

利用4种浓度的IPTG诱导BL21中pGEX-6p-79的表达4 h，收集菌液并用超声波破碎，离心后取上清直接用于SDS-PAGE分析。结果发现有一条过量表达蛋白带，大小为44 ku，与预测大小一致，所以GST-ORF79融合蛋白被正确表达。通过不同IPTG浓度表达量比较发现随着IPTG浓度降低，蛋白表达量增加，但过低的浓度也不利于蛋白表达，见图3 A；而表达时间的优化研究发现用0.1 mmol·L-1IPTG诱导表达的蛋白量差异不是很大，其中以诱导后2 h的重组蛋白表达量最大，结果见图3B。

2.4 融合蛋白的纯化与Western blotting检测

将500 mL超声处理的菌液上清经Glutathione Sepharose 4B纯化，收集洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果显示纯化后得到一条纯蛋白带，其分子质量大小约为44 ku左右，与预期大小一致，如图4所示。利用Western-blotting对纯化的蛋白进行检测，能够检测到目的条带，结果表明GST-ORF79正确表达。

图3 融合蛋白表达条件优化分析Fig.3 Optimization of expressing condition of fusion protein

图4 纯化的融合蛋白SDS-PAGE以及Western blotting检测Fig.4 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the purified fusion protein

3 讨论与结论

口服感染因子是杆状病毒感染宿主昆虫的必需因子，所以在杆状病毒中都能发现orf79的同源基因，同时不同属的病毒间又有一定的差异性，但是其中比较保守的功能域则同源性非常高。我们的分析结果表明颗粒体病毒属（GV）与BmNPV orf79的差异较大，其原因可能是病毒在与宿主的共进化过程中为适应不同的宿主发生相应的变异。在病毒蛋白的原核表达过程中，我们发现不同的诱导条件对BmNPV的ORF79重组蛋白表达有显著影响，37℃条件诱导的重组蛋白多以包涵体的形式存在（图略），而在14℃条件诱导，多以可溶形式存在，诱导的IPTG浓度及诱导表达时间也是主要的影响条件，本研究针对各影响因素对诱导条件进行了优化，获得了最优的诱导条件。在优化的诱导条件下，IPTG浓度0.1 mmol·L-1，诱导时间2 h达到峰值，这与郭庆勋以及华秋东等的探索条件有所不同，这可能与所表达的蛋白特性有一定关系[9-10]。本研究通过亲和层析方法成功从裂解液上清中纯化出重组融合蛋白，为下一步利用pull-down技术开展可溶蛋白与宿主中肠上皮细胞的互作研究以及病毒感染复合体的探索研究打下基础。

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