鹅巴氏杆菌病病原分离鉴定与中药的筛选

马 驿,陈钦旭,陈秀眉,陈均玉,彭金菊

(广东海洋大学动物医学系,广东 湛江 524088)

鹅巴氏杆菌病是由禽多杀性巴氏杆菌引起鹅的一种急性、败血性、高度接触性传染病。该病的传播途径广泛,具有较高的死亡率以及导致生产性能低下等特点,给养鹅业造成较大的经济损失。目前,治疗细菌性疾病的最常用药物是抗生素和合成抗菌药,但具有产生耐药性、导致药物残留等缺点。我国传统中药除可克服前述缺点外,还可增强动物免疫力,因此,从中药中提取有效的活性成分,以取代部分高残留药物的研究尤为重要。研究表明,中药及中药复方对巴氏杆菌有较好的体外抑制效果[1-3]。本试验从湛江市某养鹅场采集病料,进行病原分离鉴定,同时选取30种常用中药,通过测定各中药及其复方对病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),筛选出能有效抑制该菌的中药及中药复方,以期为实际生产中防治禽类细菌病提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 中药材 大黄、五味子、鱼腥草等30种中药均购自湛江市药材市场。

1.2 菌株来源 从湛江市某养鹅场采集具有典型巴氏杆菌病病理变化的病死鹅的肝、肺、脾,分离培养细菌。巴氏杆菌(C48-3)标准菌株,由中国兽医药品监察所提供。

1.3 培养基 各种生化培养基均为杭州天和微生物试剂有限公司生产;鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂斜面和1%猪血清肉汤参照文献进行配制。

1.4 细菌分离纯化 将肝、肺、脾等病料无菌接种于鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板,37℃培养18～24 h,挑取单个菌落,再进行纯培养并鉴定。

1.5 涂片染色镜检 挑取上述纯培养菌落抹片,进行革兰和美蓝染色,镜检。

1.6 细菌生化试验 将纯化好的疑似巴氏杆菌菌株分别接种到不同的生化培养基中,37℃培养24～48 h,观察结果,同时与标准菌株进行比较。

1.7 中药药液的制备 称取中药各50 g置于烧杯内,加200 m L水,置于室温下浸泡10～30 h后加热煮沸30 min,连续煎煮3次,冷却,过滤,合并煎煮液,浓缩至50 m L,使药液含原药材达1 g/m L,置于4℃冰箱内保存备用。

1.8 单药MIC与MBC的测定 将巴氏杆菌接种于1%猪血清营养肉汤中,37℃恒温培养8～12 h,采用平板计数法计数,用肉汤稀释至105CFU/m L,置于4℃冰箱内保存备用。采用液体试管二倍稀释法测定各药的MIC[4],取试管12支,于各管中加入菌液和药液,使12支试管内的菌液中药物含量分别为 :200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782、0.391、0.196、0 mg/mL 。37℃恒温培养,分别于24 h、48 h观察结果。试验重复3次。

培养24 h时,若对照管细菌生长良好发生混浊,药液管亦发生混浊,既表示细菌生长,该浓度供试药物无抑菌作用;若药液管清亮,表示细菌生长受到抑制,其为能够抑制细菌生长的最大稀释度的药液,即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。

继续培养至48 h,若药液管仍清亮,将各管清亮的药液接种于普通琼脂平板上,培养8～12 h观察,仍无细菌生长的最小药物浓度即为该药物的最小杀菌浓度(MBC)。

1.9 复方的MIC及MBC测定 根据单药的抑菌试验结果,筛选出8种对巴氏杆菌有较强抑菌作用的中药作为主药,分别与其他中药组成复方,复方的MIC及MBC测定方法与单药的方法相同。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

2.1.1 菌株分离培养 分离菌在普通培养基上生长贫瘠,在麦康凯培养基上不生长,在鲜血培养基上生长良好,长成淡灰白色、闪光的露珠状小菌落,且无溶血现象。

2.1.2 涂片染色镜检 在光学显微镜下观察发现分离菌为球杆状或短杆状,两端钝圆,以单个和成双排列为主,革兰染色阴性。涂片用美蓝染色时可见典型的两极着色。

2.1.3 分离株理化鉴定 详细结果见表1,由生化特性鉴定结果可以看出分离菌株符合巴氏杆菌特征[5],初步确定为巴氏杆菌。

表1 疑似巴氏杆菌菌株的生化试验结果

2.2 中药对巴氏杆菌的体外抑制效果

2.2.1 单味中药对巴氏杆菌的抑制作用 从表2可以看出,五倍子(MIC=3.125 mg/m L)、诃子(MIC=12.5 mg/m L)对巴氏杆菌的抑菌作用最好,其次是五味子、乌梅、山茱萸、石榴皮、夏枯草、栀子、鱼腥草,其MIC均为25 mg/mL,青蒿、花椒、秦皮、虎杖、金银花、紫草、大黄、皂角、茵陈、大青叶的MIC为 50 mg/m L,甘草、川莲等 11种中药的MIC≥100 mg/m L。杀菌作用以五倍子、五味子的效果较好,MBC均为 50 mg/m L,诃子、青蒿、甘草、川莲的杀菌效果次之,其MBC均为100 mg/m L,其余24种中药的MBC≥200 mg/mL。

2.2.2 中药复方对巴氏杆菌的抑制作用 从表3、表4可以看出,五倍子、诃子、五味子、乌梅、山茱萸、石榴皮、栀子、虎杖与其他中药组成复方后的抑菌和杀菌能力基本都大于或等于单药。其中五倍子与黄芩、白芍、青蒿、皂角、连翘、大黄组成复方的 MIC均为0.196 mg/m L,MBC≤0.781 mg/m L;诃子与白芍、白头翁、连翘、大黄、桂枝组成复方的抑菌效果明显提高,MIC≤1.563 mg/m L,杀菌效果更是显著提高,MBC≤1.563 mg/m L。

表2 单药对巴氏杆菌的体外抑制 (mg/m L)

3 讨论

3.1 细菌分离鉴定 通过病原分离、涂片镜检、生化鉴定,初步确定所分离的细菌为多杀性巴氏杆菌,试验结果为该鹅场进行疾病防治奠定了病原学基础。

3.2 中药对巴氏杆菌的体外抑制效果 本试验采用水煎法制备中药药液,该方法所需设备简单,操作简便,可以在较短的时间内完成大量中药的筛选。在30种中药中,不同药物提取液对巴氏杆菌的抑制效果差别很大,其中五倍子、诃子、五味子、乌梅等对巴氏杆菌具有较强抑菌活性,这与王晓晖等报道诃子、五味子的水煎煮液对大肠杆菌、巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌3种致病菌都有明显的抑菌作用结果一致[6]。李广京等采用试管二倍稀释法研究中药提取物对巴氏杆菌的抑菌结果显示乌梅(MIC为 1∶256)优于大黄、秦皮(MIC均为1∶32),本试验中乌梅(MIC=25 mg/m L)的抑菌活性也大于大黄、秦皮(MIC均为50 mg/m L)[7]。但部分结果与资料报道的有差异,如王晓晖等采用平皿打孔法研究中药的抑菌作用的试验结果表明,不同中药对巴氏杆菌的抑制作用从强到弱依次为诃子＞黄芩＞大黄＞五味子＞金银花[6],而本试验上述中药对巴氏杆菌的抑制作用为诃子＞五味子＞金银花＞大黄＞黄芩,这与所采用的试验方法及菌株不同有关。本试验中,部分中药提取液对巴氏杆菌的抑制效果不佳,因此对于不同致病菌,应采用具有针对性的中药进行治疗。

表4 中药复方对巴氏杆菌的最小杀菌浓度(MBC) (mg/m L)

与抗生素相比,中药的抗菌活性较低,但其药用效果是不能仅以药物的MIC和MBC来进行评价,中药对动物免疫机能的影响亦为评价其防治效果的重要指标[8-9]。中药的MIC和MBC测定结果对指导临床用药剂量有一定的参考价值,但体外抗菌试验只能说明所试中药与细菌直接接触所产生的影响,而对被细菌感染患病的动物的治疗效果,必须进行动物体内试验才能证实;另外,天然中药对动物还具有一定的营养和整体调节作用,因此,筛选出的中药在体内饲喂试验中其药效可能会有一定变化。

3.3 中药复方的抑菌效果及前景展望 中药复方抑菌试验的结果显示:五倍子、诃子、五味子、乌梅、山茱萸、石榴皮、栀子、虎杖与其他中药联用,抑菌效果与单药相比普遍提高,说明这些药物之间有协同作用,在实践中有较大的应用价值。选择多种具有不同药理作用的中草药组成中药复方制剂,具有药效互补、疗效增强,各药的单剂量与不良作用减少的优点,中药复方制剂的开发是当前中药研究的主流之一。在实际使用上更具有优势。但中药复方的研究中,复方中药的有效成分并非每味中药有效成分的总和,这些成分相互作用有简单的物理变化和复杂的化学变化(产生新的物质)。无论是单味药还是联合用药,其抑菌的具体成分、作用方式和机理如何,仍需进一步研究。

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