肠球菌产enterocin基因的检测

崔德凤,聂晓华,周 波,李焕荣,阮文科,张永红,汪 明

(1.中国农业大学动物医学院农业部动物疫病流行病学与人畜共患病重点实验室,北京 海淀 100193;2.北京农学院动物科学技术学院,北京 昌平 102206)

肠球菌属(Enterococci)是乳酸菌中对营养要求不高、兼性厌氧、容易培养、分布广泛的一类革兰阳性球菌。肠球菌广泛应用于乳制品加工、蔬菜及肉制品的发酵工艺中。肠球菌在生长繁殖过程中除产生乳酸、乙酸等有机酸外,还能产生多种具有抑菌或杀菌活性的细菌素,在抑制多种动物源病原微生物和食物病原菌、腐败菌等方面具有重要作用。

如何快速筛选和鉴定动物源产广谱细菌素乳酸菌,作为动物饲料添加剂应用或动物传染病的预防与治疗显得尤为重要。目前已报道的细菌素基因包括enterocin B,enterocin 1071 A,enterocin L50,enterocin A,mundticins等,本试验从健康猪胃肠道筛选出产广谱Enterocin的肠球菌,并对细菌素的生物学特性进行了研究,拟采用分子生物学方法对分离的12株肠球菌进行细菌素基因鉴定,为Enterocin的异源表达和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基 粪肠球菌E1～E12,由本院微生物实验室分离保存;标准菌株粪肠球菌B1和屎肠球菌B2,购自中国科学院微生物研究所;MRS培养基,PYG培养基配方略。

1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白酶、蛋白酶K Sigma公司;Taq DNA聚合酶,d NT Ps,10×PCR Buffer,核酸Marker DL-2部000,Gold view均购自北京汇天东方有限公司;Peasy-T 3克隆载体,DH5α感受态细胞,购自北京全式金生物技术有限公司;DNA回收、纯化及转化试剂,购自 Tiangen公司;PXE 0.2型PCR仪,Thermo公司产品;MLS-3020型高压灭菌锅,Sanyo公司产品。

1.3 肠球菌染色体DNA的提取 分别将12株肠球菌接种到MRS培养基中,37℃培养18h,连传3代,采用CTAB法提取肠球菌染色体DNA,取1.5 mL培养物12000 r/min离心2 min;沉淀中加入576μL的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30μL 10%SDS和15μL蛋白酶K混匀,于37℃温育1 h;加入100μL 5 mol/L NaCl充分混匀,再加入80μL CTAB/NaCl溶液,混匀后在65℃温育10 min;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1混匀,离心4～5 min,将上清转入一只新管中,加入0.6～0.8倍体积的异丙醇,轻轻混匀直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心;沉淀用1 mL的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇,自然风干;加入30μL的 TE缓冲液溶解DNA。

1.4 PCR扩增 引物设计与合成根据GenBank中报道的enterocin A 、enterocin B、enterocin as-48和enterocin T 8基因的序列,登录号分别为:AF 099088,AF121254,x94181.1和AF005726。应用软件设计用于扩增各个基因片段的特异性引物,见表1,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

在0.5 m L离心管中设置50μL PCR体系,以提取的肠球菌染色体DNA为模板,分别扩增DNA片段entA,entB,as-48和T 8,PCR反应条件为:94℃预变性 5 min,进入循环:94℃变性30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸30 s,共35个循环,最后72℃延伸10 min。预期扩增产物长度见表1。取5μL PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,以DNA Marker DL-2000为标准分子量,用凝胶成像分析系统观察结果。

表1 检测肠球菌素基因的PCR引物

1.5 PCR产物的回收与纯化 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物,切下目的条带,用DNA片段回收试剂盒回收。操作如下:按1∶3的比例加入溶胶液,使胶完全溶化,加入玻璃奶,颠倒混匀,12000 r/min离心30 s,吸弃上清,37℃烘干直至沉淀变为白色,加入适量的洗脱液,12000 r/min离心1 min,吸取上清备用。

1.6 细菌素基因的克隆与序列分析 将纯化的PCR产物连接pGEM-T Easy载体,转化DH5α载体菌,选取酶切鉴定后的阳性克隆,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。利用DNAStar Gentyx等生物学软件对检测菌株序列与Gen Bank中参考序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析,确定肠球菌细菌素基因的类型。

2 结果与分析

2.1 12株肠球菌enterocinA基因的扩增 应用设计的4对特异性引物对12株分离的肠球菌和2株标准肠球菌染色体DNA进行目的基因的扩增,采用梯度 PCR 扩增法,从 E3、E4、E5、E9、E11 、B1 和B2染色体DNA中扩增出entA基因,长度为274 bp,与预计扩增片段大小一致,见图1,未从14株菌染色体DNA中扩增出entB、as-48和T8基因。

图1 E1～E12肠球菌enterocin A PCR扩增

2.2 PCR产物的纯化与克隆 使用北京博大泰克生物基因技术有限公司生产的DNA片段回收试剂盒对entA进行回收纯化后,克隆到全式金Peasy-T 3载体上,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选具有氨苄青霉素抗性的白色菌落,提取质粒DNA,进行重组质粒的PCR鉴定。图略,鉴定正确的质粒进行DNA测序,序列分析显示该片段含有enterocin A结构基因,并分别命名为enterocin E3、enterocin E4 、enterocin E5、enterocin E9 和 enterocin E11。

2.3 肠球菌enterocin的氨基酸序列比较 图2为20株肠球菌enterocin细菌素氨基酸序列的比较,包括14株Gen Bank上的参考株涉及Ⅰ～Ⅳ型enterocin和本试验扩增出的6株enterocinA的氨基酸序列,可以看出 5株试验株与Ⅱa型参考株AB038464.1,AB292463.1,AM746970.1,GQ182975.1,GQ900435.1和X94181仅有1个氨基酸的差异,同源性达 99.76%～100%,与Ⅱb型 enterocin L50A,和enterocin L50 B以及Ⅱc型enterocin 1071A和Enterocin 1071B氨基酸差异较大,而与Ⅰ型羊毛硫抗生素Cycolysin Cyil,Ⅲ型环形热敏感性大分子量蛋白enterocin AS-48和Ⅳ型复合型细菌素enterolysin A同源性较低,进一步证明分离株肠球菌的细菌素属于Ⅱa型enterocin A。

2.4 推导enterocin A的结构预测 DNAStar结构预测显示enterocin A的第22～30氨基酸形成α区,N-端为亲水区,带正电荷;C-端则为疏水区,可以形成一个跨膜螺旋结构。

3 讨论

目前已经分离鉴定了大量肠球菌产生的细菌素,并命名为伏尔加霉素(enterocin),由于肠球菌属细菌素的多样性,在已有乳酸菌细菌素按化学组成和特性分类的基础上,根据enterocin氨基酸序列、分子量提出了新的分类方法,将enterocin分为四型,Ⅰ型硫醚抗生素enterocin(lantibiotics分子量＜4 k Da)。Ⅱ型enterocin,分子量4～8 kDa,包含前导肽序列,Ⅱ型又分为3个亚型,Ⅱa属于片球菌素家族enterocin,Ⅱb合成不需要前导肽的enterocin,Ⅱc为其他的线形非片球菌素类enterocin,Ⅲ型环形抗菌肽,Ⅳ型为大分子蛋白[1]。其中报道的enterocin绝大多数属于Ⅱ型,已分离鉴定的enterocin包括Ⅰ～Ⅳ型,其中Ⅱ型种类、数量最多,属于Ⅱa型的有enterocin A,mundticins,enterocin-CRL 35,bacteriocin31,bacteriocin T 8,bacteriocin,enterocin X和enterocin P,Ⅱb型包括enterocin L50,enterocin Q,enterocin MR108,Ⅱc型包括enterocin B,enterocin 1071 A和Enterocin 1071 B。enterocin产生菌涉及粪肠球菌、屎肠球菌、蒙氏肠球菌、嗜热肠球菌、钻黄肠球菌和耐久肠球菌等。分离菌大部分来源于食品,分离自动物的肠球菌较少,只有分离自兔子粪便的屎肠球菌[2]、分离自驯化的野鸭[3]、来自牛胃肠道的蒙氏肠球菌以及来自野猪的屎肠球菌的报道[4]。屎肠球菌和粪屎肠球菌为enterocin主要产生菌,不同来源的同种肠球菌可以产生相同的细菌素,也发现了同一株肠球菌可以产生多种细菌素[5]。

本试验检测并分析了12株分离自健康猪胃肠道肠球菌产生细菌素的基因及其遗传特征,从其中5株菌 E3、E4、E5、E9、E11 扩增出 entA 基因,与GenBank上enterocin A的同源性达99.76%～100%,根据细菌素氨基酸的结构和组成及其生物学特性,表明5株肠球菌产生的细菌素属于Ⅱ型中的Ⅱa亚型。

图2 分离株与Ⅰ～Ⅳ型enterocin的氨基酸序列比较

肠球菌产生的细菌素包括enterocins A,P,CRL 35,1071 A和B,mundticin,mundticin KS,bacteriocin 31,RC714,T 8 and enterolysinA,enterocins A由于N端含有YGNGVXC序列并包含4个半胱氨酸残基组成二硫键而属于Ⅱa,这些特征与同属此型的片球菌家族pediocin PA-1/AcH相同[5],enterocins A分离自肠球菌 ,来源有发酵香肠、乌榄、奶酪、米糠等,enterocinsA由 47个氨基酸组成,前导肽 18个氨基酸,组成细菌素前体,由ABC运转体在辅助蛋白的协助下转运到细胞外,enterocins A结构基因编码103个氨基酸的免疫蛋白,与编码leucocin A免疫蛋白具有40%的同源性,enterocins A分子量大约4800 Da,enterocinsAS-48,B,EJ97,RJ11,MR10A&B,Q and L50A&B和bacteriocin 32由于结构和遗传特征不同于其他乳酸菌产生的细菌素而归属于Ⅱb、Ⅱc和Ⅲ型。细菌素氨基酸序列分析揭示,enterocin E5具有Ⅱa亚型的典型特征,N端片球菌素共有基序YGNGVXC和4个半胱氨酸残基形成的2个二硫键稳定结构为enterocin A拥有活性的关键因素,carnobacteriocin B2共有基序置换后,对靶细胞的抗菌活性明显降低[6],可见共有基序在细菌素产生菌的抑菌活性上起着重要的作用。

Ⅱa细菌素的结构基因编码的细菌素前体,包括N-端延伸序列和C-端成熟肽部分。N-端延伸序列,为双甘氨酸型(G-G-X)前导肽或者信号肽序列。延伸肽指导细菌素通过ABC转运蛋白机制或者sec-依赖机制进行跨膜转运。本试验扩增的enterocin E5的entA结构基因含有198个核苷酸,推导的基因产物为65个氨基酸的细菌素前体,N-端为由18个氨基酸组成的典型双甘氨酸型前导肽。与其他Ⅱa细菌素的前导肽呈现较低的相似性。前导肽出现在大多数非硫醚细菌素和少数硫醚细菌素,来源不同菌株的enterocin A结构基因具有99.72%同源性,推导的氨基酸序列完全相同。伴随细菌素转运过程前体中的N-端前导肽序列在双甘氨酸位点处被切除释放成熟的细菌素分子,由47个氨基酸组成,含有4个半胱氨酸形成了2个链内二硫键,Ent A的N-端含有保守的YGNGV序列,具有亲水性,C-端具有疏水性,形成跨膜α-螺旋结构。推导的enterocin E5的分子量为4829 Da,氨基酸序列与enterocin A的完全一致。研究表明,Ⅱa型中的细菌素具有不同的三维结构,反映了对其靶细胞特异性的差异[7]。

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