鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK双抗原DNA疫苗的免疫保护效果观察

徐守振,汪 明

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东 青岛 266109;2.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

鸡球虫病(coccidiosis of chickens)是一种严重危害养禽业的常见寄生虫病。由于鸡球虫活苗存在安全性和使用不便等缺点,因此寻找一种更安全、稳定和高效的新型疫苗成为亟待解决的问题。DNA疫苗具有制备简单、可持续诱导体液及细胞免疫反应等优点,近年来成为鸡球虫疫苗研究的热点[1]。研究发现针对鸡球虫单一保护性抗原的DNA疫苗不具备完全的免疫保护[2-3],研制含多个保护性抗原的多价DNA疫苗可能是提高保护效果的策略之一。

本试验将E.tenella 3-1E和CDPK两基因融合构建了双抗原DNA疫苗,研究其免疫保护效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄AA肉鸡,购自北京华都肉鸡有限公司。

1.2 虫株和质粒 E.tenella GS敏感虫株、真核载体proVAX、PK-15细胞为青岛农业大学寄生虫教研室保存。pGEX-C原核质粒和pro E真核质粒为试验前期构建。

1.3 主要试剂 限制性内切酶Eco RⅠ、XhaⅠ、XbaⅠ、AMV反转录试剂盒、DNA连接试剂盒、DNA回收纯化试剂盒,为宝生物工程(大连)有限公司产品。EndoFree Plasmid Maxi Kit,QIAGEN公司产品。脂质体转染试剂盒(LipofectamineTM),Invitrogen公司产品。

1.4 引物设计 根据E.tenella 3-1E和CDPK基因序列及SOE-PCR引物设计原理,设计4条引物如 下 。 P3:5′-CCGGAAT TCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3′,P10:5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCC CTGG TACAG-3′,P9:5′-GGT TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGG TGGCGGA TCGA TGCCGGCAGCGTCCAAGTCAG-3′,P6:5′-TGCTCTAGA CTACGCCGCGGTA TCTCCGCAC-3′,两基因序列间 linker1:5′-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3′,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 融合基因扩增 以pro E为模板,P3、P10引物扩增 3-1E-linker1,条件:94℃5 min,94℃1 min,58℃1 min,72℃1 min,30个循环;72℃10 min。以pGEX-C为模板,P 9、P 6引物扩增linker1-CDPK,条件:94℃5 min,94℃1 min,64℃1 min,72℃1.5 min,72℃10 min,30个循环。各取1μL回收纯化的两片段作模板,P 3、P6引物扩增3-1E/CDPK(EC)融合基因,条件:94℃5 min,94℃1 min,58℃1 min,72℃2 min,3个循环;94℃1 min,60℃1 min,72℃2 min,3个循环;94℃1 min,62℃1 min,72℃2 min,3个循环;94℃1 min,64℃1 min,72℃2 min,20个循环;72℃10 min。

1.6 真核质粒构建与鉴定 将EC融合基因、pGEXC、proVAX 分别用Eco RⅠ+XbaⅠ双酶切,连接、转化及酶切鉴定均按常规方法操作,鉴定正确的阳性克隆命名为proEC和proC。无内毒素的proC和proEC质粒体外转染PK-15细胞,转染后30 h用间接免疫荧光试验(IFAT)检测重组质粒中目的蛋白表达情况,首抗为兔抗rIEC重组蛋白抗体(1∶100),二抗为羊抗兔FITC标记抗体(1∶200)。

1.7 动物分组与处理 5日龄AA肉鸡随机分为空白对照组、攻虫对照组、proVAX组、proE组、proC组和 pro EC组;7日龄,首次免疫 porVAX、pro E、pro C和pro EC(50μg/只);14日龄,加强免疫1次;21日龄,称重,感染5×104个 E.tenella GS株孢子化卵囊;28日龄,称重、剖杀。

1.8 淋巴细胞转化试验 27日龄,心脏采血 2 mL/只,按常规方法做淋巴细胞转化试验(M TT法),用特异刺激抗原rIEC和非特异刺激抗原ConA分别刺激分离的淋巴细胞,计算刺激指数SI=待测孔OD值/空白对照孔OD值。

1.9 血清抗体效价检测 13、20、27日龄,翅静脉采血,分离血清,间接ELISA检测血清抗体效价,包被抗原为rIEC(1μg/孔),二抗为羊抗兔HRP-IgG(1∶1000)。

1.10 免疫保护效果评价 28日龄,称重、剖检,计算相对增重率、盲肠内容物克粪便卵囊数(OPG)。

1.11 数据处理 采用SPSS 12.0软件分析各组间差异。

2 结果

2.1 真核质粒的构建与鉴定 用Eco RⅠ+XbaⅠ对proC和proEC双酶切后释放出1500 bp和2000 bp的目的片段,用Eco RⅠ+XhaⅠ对proE双酶切释放出 500 bp的目的片段(见图 1)。将proE、proC、proEC、proVAX 分别转染PK-15细胞,荧光显微镜下可见proE、proC和pro EC转染的细胞浆出现特异黄绿荧光,转染pro VAX的无特异荧光,表明构建的重组质粒正确。

图1 重组质粒的双酶切鉴定

2.2 淋巴细胞转化 攻虫感染7 d后,ConA刺激后proEC组SI与其他各组差异显著(P＜0.05);rIEC刺激后,proEC组SI除与proE组差异不显著外与其他各组差异均显著(见图2),proEC组SI均最高。

图2 DNA疫苗免疫后淋巴细胞转化水平变化

图3 DNA疫苗免疫后抗体水平变化

2.3 血清抗体效价 各疫苗组抗体水平均随免疫次数增加而缓慢提高(见图3)。首免及二免后1周,proC组抗体水平均低于其他疫苗组且差异显著(P＜0.05)。二免后1周,pro EC组高于其他各组且差异显著(P＜0.05)。感染后1周,proEC组抗体水平最高且与其他各组差异显著(P＜0.05),proE与pro C组间差异不显著(P＞0.05)。

2.4 免疫保护效果 由表1可见,疫苗组均可提高相对增重、降低卵囊产量,pro E组相对增重最高(87.39%),且与proC组和proEC组差异显著(P＜0.05),而proEC组相对增重低于pro E组和proC组。proEC组OPG最低,与proE组和proC组差异不显著(P＞0.05),proC组与proE组OPG差异也不显著(P＞0.05)。

3 讨论

鸡球虫属于真核生物,寄生性原虫,其生活史复杂,基因组较大,抗原基因构成复杂,目前大多数含单一抗原的鸡球虫DNA疫苗免疫保护效果均不理想 。先前我们研究发现,用含E.tenella3-1E和鸡IFN-γ基因的融合质粒pro IE免疫鸡后能获得比单价pro I和 proE更强的免疫保护,说明细胞因子IFN-γ与鸡球虫3-1E抗原基因共表达可增强3-1E DNA疫苗的免疫保护力。因此,研制含多种保护性抗原的鸡球虫多价DNA疫苗预期可产生较好的保护。

表1 DNA疫苗免疫保护效果观察

本试验构建了含E.tenella子孢子表面抗原3-1E和CDPK的双价DNA疫苗攻虫,免疫后发现双价pro EC较单价proE和proC能进一步降低卵囊产量,表现出一定的双抗原融合表达的协同保护优点,与周建民(2005)的研究结果基本一致[4]。为增强疫苗的保护效果本试验选用proVAX真核表达载体,其具有CMV启动子、BGH poly A和卡那霉素抗性基因,并携带有协助抗原蛋白进入分泌途径的人绒毛膜促性腺激素信号肽序列。此外,试验采用SOE-PCR技术通过在两基因间加入(GGGGS)315个具有良好柔顺性和折叠性的接头序列将两基因融合,尽可能不影响3-1E和CDPK的天然结构,确保表达的两抗原表位间不发生互相屏蔽。

本试验鸡球虫DNA疫苗诱导细胞免疫的能力强于诱导体液免疫能力,说明鸡球虫感染真正产生免疫保护作用的细胞免疫,而体液免疫的作用很小。攻虫感染后1周,除相对增重率外,proEC组淋巴细胞转化能力、抗体水平和卵囊下降率在各组中均为最高,四者间没有呈现出完全一致的关系,说明鸡球虫DNA疫苗的免疫保护机制十分复杂,仍需进一步研究。

[1]吴绍强,蒋金书,刘群,等.鸡球虫疫苗研究进展[J].畜牧兽医学报,2005,36(1):1-5.

[2]徐守振,潘保良.鸡IFN-γ与鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E抗原共表达DNA疫苗的免疫保护性研究[J].中国兽医杂志,2010,46(9):5-7.

[3]Song K D,Lillehoj H S,Choi K D,etal.A DNA vaccine encoding a conserved Eimeria protein induces protective immu nity against live E imeria acervu lina challenge[J].Vaccine,2000,19:243-252.

[4]周建民.鸡球虫3-1E和CDPK基因工程苗的研制及其免疫保护效果[D].北京:中国农业大学,2005.