MGMT在肾细胞癌中的研究

刘 刚， 关英华， 于江华， 王晓彬， 张明星， 窦中岭， 梁 豪

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统肿瘤的常见病，发病率居第二位，仅次于膀胱癌，近年来，肾癌的发病率有上升趋势，据美国文献报道，自 1970年来，肾细胞癌发病率为 2.3% ～4.3%，且呈逐年递增趋势，导致每年有超过35 000例新增患者和12 000的死亡人数［1-2］，其中有60%的肾癌是偶然发现的［3］，而这些偶发癌大部分具有小肾癌和不易发生转移的特点［4］。

肿瘤的发生与发展是一个多因素、多阶段、长期相互作用的过程，与DNA损伤程度以及修复能力密切相关。人体的DNA长期暴露在理化因素的环境中(电离辐射和化学物质)以及异常代谢产物中(氧自由基)而遭受袭击，引起DNA化学结构及其编码特性的改变而致DNA损伤，这些损伤如果不能得到及时有效的修复，细胞的正常活动就会受到破坏，并由此诱发一系列的遗传疾病乃至肿瘤的发生。DNA损伤修复是机体对DNA损伤所产生的重要生物学反应，其通过各种不同的损伤修复通路对DNA序列中损伤的、错配的或不合适的碱基进行修复，以保证基因遗传的稳定性［5］。

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)是自然界中各种生物体内普遍存在的一种独特DNA修复酶。人类 MGMT基因定位于10 q26，为单肽结构，其cDNA长约769 bp，编码207个氨基酸组成的蛋白质，含有5个外显子和4个内含子，第4外显子中的半胱氨酸残基为烷基受体，是蛋白酶的活性部位。人MGMT基因稳定地存在于所有正常组织细胞内，多在具有分裂增殖能力的正常及癌变的胃、结肠靠近管腔侧腺上皮细胞核内，研究结果提示其主要分布于活性基团转录的部位。MGMT是一种DNA修复酶，其主要作用是保护DNA免受烷化剂的损伤，从而阻止肿瘤的发生，而且有研究表明许多肿瘤的发生发展与MGMT缺失与突变关系密切［6-7］。

MGMT表达缺失或活性降低是否与肾细胞癌的发生发展机制有关，国内外报道甚少。因此，本研究采用免疫组织化学方法检测80例肾细胞癌组织和30例癌旁组织及20例正常肾组织中MGMT的表达，探讨MGMT表达的异常与肾细胞癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选取河南科技大学第一附属医院泌尿外科2009年1月—2011年1月间诊断明确的肾细胞癌手术切除标本80例，癌旁组织30例，另在河南科技大学法医学院取正常肾组织20例。肾细胞癌患者中男62例，女18例，年龄35～80岁，平均63.3岁;肾细胞癌分期按2002年TNM分期系统(AJCC):T1+T262例、T3+T418例;分化程度按WHO1997分级法:高分化34例、中分化35例、低分化11例。所有标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续组织切片，行免疫组织化学染色。

1.2 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学(SP法)，鼠抗人MGMT单克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB显色，苏木素复染。用已知阳性标本切片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判断 细胞核、细胞浆或两者均出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥10%为阳性，阳性细胞数＜10%为阴性，结果的判读由两名高级病理诊断医师审核。

1.4 统计学方法 所有数据经SPSS17.0软件进行统计学分析处理，结果采用χ2检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 肾细胞癌、癌旁组织及肾正常组织的MGMT表达 MGMT在肾正常组织、癌旁组织及肾细胞癌中的阳性表达率依次为 65.0%、76.7%、32.5%，差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.2 MGMT表达与肾细胞癌病理参数的关系MGMT在肾细胞癌中各个病理分级中的表达依次为高分化47.1%、中分化28.6%、低分化 9.1%，差异均有统计学意义(均P＜0.05);在各个临床分期中依次为 T1+T248.6%、T3+T418.6%，差异有统计学意义(P＜0.05)。MGMT表达与患者性别、年龄、肿瘤数量、患病次数均无明显相关性(P＞0.05)，详见表1。

3 讨论

肾细胞癌的发生与发展是多个因素参与的复杂的过程，与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关［8］。传统的观点认为肿瘤的发生通常是基因损伤累积的结果，随着研究的进展，国内外许多学者又发现基因启动子异常甲基化和肿瘤的发生关系密切，而基因启动子非甲基化正常状态的维持则是靠甲基化转移酶的作用来实现。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)是从细菌到哺乳类动物机体中存在的一种独特DNA修复酶，其同时发挥转移酶与甲基接受体的作用，在DNA交联形成前将烷化基团从O6-mG的O6位转移到自身半胱氨酸残基上，使 DNA链上的鸟嘌呤损伤修复，同时MGMT在转甲基后不可逆地失去活性。MGMT是体内唯一可以去除这种甲基化损伤的DNA修复酶［9］，其可将O6鸟嘌呤加合物从DNA上移除，阻止肿瘤的发生。MGMT不仅在保护细胞免受烷基类物质的毒性、突变性和致癌活性中具有决定性作用，同时也维持了其他抑癌基因的功能。Virmani等［10］通过研究发现MGMT启动子甲基化程度与宫颈病变发展程度一致。Allay等［11］发现MGMT过度表达能明显降低淋巴瘤的发生率。Eads等［12］研究发现Barrett食管发展到腺癌与MGMT甲基化关系密切。Park等［13］研究发现胃癌MGMT启动子甲基化与淋巴结转移、肿瘤分级以及生存期有明显相关性。

表1 MGMT表达与肾细胞癌病理参数的关系

我们采用免疫组化SP法研究MGMT在20例正常肾组织、30例癌旁组织及80例肾细胞癌中的表达，结果显示MGMT在正常肾组织中的阳性表达率为65.0%(13/20)，在癌旁组织中的阳性表达率为76.7%(23/30)，在肾细胞癌中的阳性表达率为32.5%(26/80)，差异有统计学意义(P=0.000)。而且主要表达于细胞浆或细胞核，表明MGMT的低表达可能与肾细胞癌由正常组织发展而来的过程有关，在胞浆或胞核中起作用。

本组结果MGMT在肾细胞癌中的表达明显低于正常肾组织和癌旁组织，癌组织中的DNA损伤不能得到及时有效地修复，表明MGMT表达水平降低在肾正常组织逐渐演变为肾细胞癌的过程中起到了促进作用，这也与大多数学者的研究结果一致，MGMT可以作为检测肾细胞癌的肿瘤指标之一。

本组结果还显示MGMT的阳性表达与肾细胞癌的分化程度显著相关(高、中、低分化分别为47.1%、28.6%、9.1%)(P ＜ 0.05)，与临床分期也显著相关(T1+T248.6%、T3+T418.6%)(P ＜0.05);与患者性别、年龄无明显相关性(P＞0.05)。

MGMT蛋白由O6-烷化鸟嘌呤-DNA烷基转移酶介导，在不需要任何辅助因子或其他蛋白质的条件下，特异性地对由致癌剂亚硝酸盐类引起的胞嘧啶O4或鸟嘌呤O6位上的化学加合物起作用，可以催化DNA分子中胞嘧啶O4或鸟嘌呤O6位上的甲基、二氯乙基等一大类烷化基，使其转移至自身肽链145位的半胱氨酸残基上使他们失活，使DNA链上鸟嘌呤损伤修复，恢复DNA原来的化学结构、状态和功能的完整性。大量资料表明，MGMT含量与肿瘤发生呈明显负相关，而MGMT甲基化在肿瘤的发生与发展中担负重要作用。Cooper等［14］研究显示，MGMT的表达减少与肺癌的发生及转移明显相关，而且更易发生在伴有转移的晚期肺癌的患者中。

在本实验中，MGMT在肾细胞癌中表达与其病理组织学分级呈负相关，即肿瘤的恶性程度越高而MGMT的表达越低，提示组织细胞中MGMT含量降低后，更多的DNA损伤没有得到及时有效修复。Zhou等［15］研究发现，组织细胞内MGMT表达缺失或活性降低会使DNA损伤不能得到及时修复从而导致基因突变不断累积，增加细胞癌变机率。由此我们可以推断，当检测到肿瘤组织中MGMT表达明显降低时即可认为肿瘤的恶性程度较高，检测MGMT可作为诊断肾细胞癌的指标之一。MGMT在肾细胞癌中表达水平与其临床分期也呈负相关，即T3+T4中表达明显低于T1+T2，提示MGMT低表达则预示着肾细胞癌的临床分期进展较高，其可以作为判断肾细胞癌预后的指标，并为临床治疗肾细胞癌提供一定的指导作用。

MGMT蛋白的表达可能成为一种预判RCC预后的重要肿瘤标记物，从而指导临床治疗方案的选择。但是国内外对MGMT在肾细胞癌研究甚少，确切发病机制还不是十分清楚，本次研究收集的标本数量也不够充分，这将是我们下一步的研究方向。

［1］ Chow WH，Devesa SS，Warren JL et al.Rising incidence of renal cell cancer in the United States［J］.JAMA，1999，281(17):1628-1631.

［2］ Jemal A，Murray T，Ward E et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin ，2005，55(1):10-30.

［3］ Janzen NK，Kim HL，Figlin RA et al.Surveillance after radical or partial nephrectomy for localized renal cell carcinoma and management of recurrent disease［J］.Urol Clin North Am，2003，30(4):843-852.

［4］ Patard JJ，Dorey FJ，Cindolo L et al.Symptoms as well as tumor size provide prognostic information on patients with localized renal tumors［J］.J Urol，2004，172(6 Pt 1):2167-2171.

［5］ 杨敏，许建宁.DNA修复通路间的相互作用及对肿瘤风险性评估的影响［J］.国外医学·卫生学分册，2006，33(6):330-334.

［6］ Matsukura S，Miyazaki K，Yakushiji H，et al.Combined loss of expression of O6-methylguanine-DNA methyltrasferase and hmlh1 accelerates progression of hepatocellular carcinoma［J］.J Surg Oncol，2003，82(3):194-200.

［7］ Dendale R，Vincent-Salmon A，Mouret-Fourme E，et al.Medullary breast carcinoma:prognostic implication of p53 expression［J］.Int J Bio1 Markers，2003，18(2):99-105.

［8］ 马建辉，何志嵩，郭军，等.肾细胞癌诊断治疗指南［M］//那彦群.中国泌尿外科疾病诊断治疗指南.2009版.北京:人民卫生出版社，2009，4-12.

［9］ Fox JG，Wang TC.Inflammation，atrophy，and gastric cancer［J］.J Clin Invest，2007，117:60-69.

［10］ Virmani AK，Muller C，Rathi A，et al.Aberrant methylation duringcervical carcinogenesis［J］.Clin Cancer Res，2001，7(3):584-589.

［11］ Allay E，Veigl M，Gerson SL，Mice overexpressing human O6-alkyl-Guanine-DNA alkyltransferase selectively reduces O6-methylguaninemediated carcinogenic mutations to threshold levels after N-methyl-N-nitrosourea［J］.Oncogene，1999， 18(25):3783-3787.

［12］ Eads CA，Lord RV，Wickramasinghe K，et al.Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2001，61(8):3410-3418.

［13］ Park TJ，Han SU，Cho YK，et al.Methylation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene is associated significantly with Kras mutation，lymph node invasion，tumor staging，and disease free survival in patients with gastric carcinoma［J］.Cancer，2001，92(11):2760-2768.

［14］ Cooper WA，Kohonen Corish MR，Chan C，et al.Prognostic significance of DNA repair proteins MLH1，MSH2 and MGMT expression in non-small-cell lung cancer and precursor lesions［J］.Histopathology，2008，52(5):613-622.

［15］ Zhou ZQ，Manguino D，Kewittk，et al.Spontaneous hepatocellular carcinoma is reduced in transgenic mice over expressing human O6-methylguanine-DNA-methyltransferase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(22):12566-12571.