NGAL、MMP-9在食管癌中的表达及其临床意义

刘文健， 王茂生

我国是食管癌高发地区之一，其病因及发病机制错综复杂，至今尚未明确。人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Lipocalin家族的成员之一，由Kjeldsen等在中性粒细胞的特殊颗粒中首先发现的25 kD的糖蛋白［1］。有研究表明NGAL能调节基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性，并可能参与肿瘤的发生发展特别是肿瘤的浸润转移等过程［2-3］。MMP-9属于锌肽酶超家族成员之一，能降解对肿瘤转移起屏障作用基底膜的主要成分Ⅳ型胶原，可能在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用［4］。有关MMP-9与食管癌浸润、转移关系虽有部分文献报道，但NGAL与食管癌浸润、转移关系的研究，迄今国内外均未见报道。本文旨在探讨NGAL与MMP-9在食管癌发生、发展中的作用，并探讨两者的相关性，寻找食管癌早期诊断和判断预后的新指标。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集茂名市人民医院2006年1月至2010年12月食管癌手术切除标本58例，其中男性34例，女性24例，年龄45～88岁，平均年龄(61.6±4.5)岁;病理证实均为食管癌，其中鳞癌48例、腺癌10例;高、中、低分化分别为13、24、21例;伴有淋巴结转移者38例，无淋巴结转移者20例。所有患者术前均未行放化疗及其他治疗史。另选取18例活检正常食管组织。全部标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，以备免疫组化使用。

1.2 主要实验试剂 SABC免疫组化试剂盒、兔抗NGAL多克隆抗体、兔抗MMP-9多克隆抗体、DAB显色剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 免疫组化及 HE染色 采用 ABC法，兔抗NGAL多克隆抗体、兔抗MMP-9多克隆抗体用PBS稀释，稀释倍数为1∶300，每个标本蜡块取4张切片，分别标上A、B、C、D(A为检测NGAL的表达，B为检测MMP-9的表达，C为HE染色，D为阴性对照)脱蜡，抗原经高温高压修复处理，抗原修复液为枸橼酸盐缓冲液，PBS冲洗，滴加一抗，4℃湿盒过夜，滴加生物素化通用型二抗，经DAB染色，苏木素复染后，常规乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。严格按照说明书步骤操作。显微镜观察，以胞浆有棕色颗粒者为阳性细胞。在400倍光镜下选取表达区域摄像，用Image-Pro Plus 5.1图像处理与分析系统对收集图像进行处理。

1.4 结果判断 检测均以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。镜下观察肿瘤细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性。采用Garvia的判定方法评判MMP-9和NGAL表达的强度:(1)细胞胞质着色深浅，基本不着色为0，浅棕色为1，深棕色为2。(2)阳性着色细胞比例，＜20%为1，20% ～50%为2，＞50%为3。(3)以上2项相加，2为(+)，3～4为(++)，＞4为(+++)。(4)未着色细胞质为(－)。(5)≥3为高表达，＜3为低表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。两样本率的比较及两蛋白之间的相关性采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌与正常食管组织中NGAL与MMP-9的表达 由表1、图1～9可见NGAL与MMP-9在食管癌中的表达明显高于其在正常食管组织中的表达，其差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 NGAL与MMP-9在食管癌中的表达与临床病理指标的关系 由表2可见NGAL与MMP-9在食管癌中的表达与患者的性别、年龄、组织学类型无关(P＞0.05)，而与肿瘤的浸润、分化程度、淋巴结转移密切相关(P ＜0.05)。

2.3 NGAL与MMP-9在食管癌中表达的相关性由表3可见NGAL和MMP-9两者都是阴性的有8例，一为阴性一为阳性17例，两者均为阳性33例;统计学分析显示NGAL和MMP-9在食管癌中的表达存在关联性(r=0.572，P ＜0.05)。

表1 不同食管癌组织中NGAL、MMP-9表达情况

图1～3 分别为正常食管组织、鳞癌、腺癌的HE染色

图4～6 分别为NGAL在正常食管组织、鳞癌、腺癌中的表达

图7～9 分别为MMP-9在正常食管组织、鳞癌、腺癌中的表达

3 讨论

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌，其发病率和死亡率各国差异很大，我国是食管癌高发地区之一。浸润和转移是食管癌晚期致死的主要原因之一。恶性肿瘤的浸润和转移是以细胞外基质和基底膜降解为关键环节。MMP-9可特异性地降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原，促进新生血管的形成，参与肿瘤细胞的侵袭转移［4］。MMP-9在食管癌中呈现过表达并在浸润转移中扮演着重要角色［5］。国内刘威、王宪远等研究认为，血浆MMP-9的水平与肿瘤的侵袭能力呈正相关［6-7］。有研究显示NGAL基因可能是人类的一种新的癌基因，但其在肿瘤中的确切功能尚不清楚。NGAL与食管癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌和白血病等其他恶性肿瘤的发生发展及其预后有着密切关系［3-8］，是一种具有多功能的25 kD糖蛋白，可通过二硫键结合MMP-9 并调节其活性［9］。Kubben、Zhang 等［10-11］研究表明NGAL/MMP-9的水平及其基因表达均与肿瘤的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移呈正比关系。李恩明等［12］研究认为，NGAL基因在肿瘤中的作用可能是调节保护MMP-9，并与之形成异源二聚体(NGAL/Pro-MMP-9)，并以此促进恶变细胞的浸润转移。

本实验研究发现NGAL、MMP-9在食管癌组织中的表达明显增高，且二者的表达存在密切的相关性，在食管癌的发病过程中可能存在协同作用。食管癌组织中NGAL与MMP-9的表达强度与食管癌的分化程度、浸润及转移关系密切，二者高表达预示着肿瘤有较强的侵袭力和较差的预后，有望成为食管癌诊断的新的分子指标并对食管癌的转移及预后有着重要的参考意义。但两者具体的协同机制尚有待于进一步研究。

表2 NGAL、MMP-9表达与食管癌患者临床病理指标的关系

表3 食管癌中NGAL与MMP-9表达的相关性

［1］ Kjeldsen L，Johnsen AH，Sengelv H，et al.Isolation and prima

ry structure of NGAL，a novel protein associated with human neutrophil gelatinase［J］. BiolChem， 1993，268 (14):10425-10432.

［2］ Sousa MM，do Amaral JB，Guimares A，et al.Up-regulation of the extracellular matrix remodeling genes，biglycan，neutrophil gelatinase-associated lipocalin，and matrix metalloproteinase-9 in familial amyloid polyneuropathy［J］.FASEB J，2005，19(1):124-126.

［3］ 许丽艳，李恩民，熊华淇，等.NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究［J］.生物化学与生物物理进展，2001，28(6):839-843.

［4］ Ohashi K，Nemoto T，Nakamura K，et al.Increased expression of matrix metalloproteinase 7 and 9 and membrane type 1-matrix metalloproteinase in esophageal squamous cell carcinomas［J］.Cancer，2000，88(10):2201-2209.

［5］ Tanioka Y，Yoshida T，Yagawa T，et al.Matrix metalloproteinase-7 and matrix metalloproteinase-9 are associated with unfavourable prognosis in superficial oesophageal cancer［J］.Br J Cancer，2003，89(11):2116-2121.

［6］ 刘威，秦凤玲，赵琪.基质金属蛋白酶-9与食管癌转移［J］.医药论坛杂志，2005，19(17):38-39.

［7］ 王宪远，何炜，许迎朝.金属基质蛋白酶-9与食管癌预后的关系［J］.河南医学研究，2005，14(3):235-236.

［8］ 蒋奶贵，许丽艳，郭明洲，等.肿瘤相关蛋白NGAL的生物学特征［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2010，19(4):297-301.

［9］ Yan L，Borregaard N，Kjeldsen L，et al.The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase(MMP)activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL).Modulation of MMP-9 activity by NGAL［J］.J Biol Chem，2001，276(40):37258-37265.

［10］ Kubben FJ，Sier CF，Hawinkels LJ，et al.Clinical evidence for a protective role of lipocalin-2 against MMP-9 autodegradation and the impact for gastric cancer［J］.Eur J Cancer，2007，43(12):1869-1876.

［11］ Zhang XF，Zhang Y，Zhang XH，et al.Clinical significance of NGAL mRNA expression in human rectal cancer［J］.BMC Cancer，2009，9(1):134.

［12］ 李恩民，许丽艳，蔡唯佳，等.SHEEC食管癌细胞中NGAL基因的功能［J］.生物化学与生物物理学报，2003，35(3):247-254.