siRNA下调TROP-2基因表达对人胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响

瞿彩兴， 马 圭， 范 钰

近年来，胰腺癌发病率明显增高。肿瘤转移是细胞迁移侵袭的结果，也是导致治疗失败的主要原因。恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多阶段多步骤的过程，许多基因共同调控导致其表达产物改变，影响其生物学行为。研究发现，肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(tumor-associated calcium signal transducer-2，TROP-2)基因在人胰腺癌组织中高表达，且与癌细胞侵袭有关［1］。但是国内相关的研究甚少，2011年3月—2011年5月，本课题组以胰腺癌CFPAC-1细胞为模型，考察小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术对胰腺癌细胞中TROP-2表达、胰腺癌细胞迁移及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人胰腺癌CFPAC-1细胞株为本院组织细胞生物库冻存。TROP-2基因siRNA购自德国Qiagen公司。RBMI 1640培养液购自美国GIBCO公司;Trizol、RealTime PCR扩增试剂盒和脂质体转染试剂LipofectamineTM2000及逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司;鼠抗人TROP-2及β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司;基底膜基质Matrigel购自美国Becton Dickinson公司。

1.2 细胞培养 胰腺癌CFPAC-1细胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI 1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。待对数生长期时，收取细胞，进行以下试验。

1.3 siRNA转染 借助于 LipofectamineTM2000进行转染，具体操作参照说明书进行。转染前1d，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1 mL/孔，培养过夜，次日进行转染。细胞分组:(1)空白对照组(Con-A)为未经任何处理的胰腺癌细胞;(2)空载对照组(Con-B)为脂质体对照组;(3)siRNA组为10%FBS的RPMI 1640中含不同浓度的已用脂质体包埋的siRNA。

1.4 胰腺癌细胞TROP-2 mRNA水平检测 采用荧光实时定量RT-PCR方法检测。收集细胞，以TRIzol抽提细胞总 RNA，取总 RNA 1 μg，以 oligo dT(15 mer)为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2 μL为模板进行PCR扩增，步骤参照逆转录试剂盒说明书进行。TROP-2上游引物序列为5'-TCCACTTGTATCATGGCCTACC-3'，下游引物序列为:5'-CTCAAAGACATCCAAACTGCGT-3'，扩增片段长度111 bp。β-actin上游引物序列为:5'-CACG AAACTACCTTCAACTCC-3'，下游引物序列为:5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3';扩增片段长度262 bp。PCR反应条件为:95℃，预变性3 min，95℃，30 s;52℃，45 s;72℃，45 s;35个循环后，72℃再延伸7 min。反应后生成熔解曲线。TROP-2基因表达值以 2-ΔΔCt表示［2］。

1.5 TROP-2基因蛋白水平检测 采用免疫荧光法检测。将胰腺癌细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，细胞和盖玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加TROP-2单克隆抗体(1∶1 000)覆盖整个切片，4℃过夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀释的FITC标记的二抗，37℃保温30 min。PBS振洗2次后用蒸馏水振洗。50%缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察，拍照，荧光强度扫描。

1.6 细胞迁移检测 根据参考文献［3］方法，采用划痕实验(wound-healing Assay)方法检测。将细胞接种于6孔板，以含10%FBS的培养基培养至细胞将近长满，换无血清培养基培养24 h后，以l mL移液器吸头在细胞层仔细划痕，以PBS洗两遍，去除细胞碎片，更换含10%FBS的培养基继续培养20 h，倒置显微镜下对划痕前后的相应区域拍照。实验设3个平行孔，重复3次。倒置显微镜下测量细胞向致伤区迁移的相对距离，根据原始细胞致伤区距离计算出细胞实际迁移距离。

1.7 细胞侵袭检测 根据参考文献［3］方法，采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭能力:Boyden小室上下室之间铺聚碳酸醋微孔滤膜(孔径8 μm)，滤膜上包被有Matrigel。用无血清培养基准备单细胞悬液，并调整浓度为2.5×104/mL。细胞以500 μL无血清培养基重悬，接种于培养小室的上层，小室下层加入500 μL含10%FBS的培养基作为趋化物。在37℃，5%CO2，饱和湿度条件下分别培养72 h后，用棉拭子去除上室底部基质胶并移除未侵袭细胞;接着固定 30 min，PBS漂洗 2次;HE染色30min。随机选择5个100倍显微视野，统计视野中的总细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。每组设3个平行样本，取其平均值，进行统计学分析。

2 结果

2.1 siRNA转染对胰腺癌CFPAC-1细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平的影响 定量PCR和免疫荧光结果显示，siRNA转染组细胞TROP-2蛋白水平明显下降，且呈浓度和时间依赖性(P＜0.001;P＜0.001)。见图1，2。

图1 siRNA转染对胰腺癌CFPAC-1细胞TROP-2基因mRNA水平的影响

图2 siRNA转染对胰腺癌CFPAC-1细胞TROP-2基因蛋白水平(×102)的影响

2.2 siRNA转染对胰腺癌CFPAC-1细胞迁移的影响 划痕试验结果显示，TROP-2 siRNA转染组迁移距离明显低于对照组(P＜0.001)。见图3。

2.3 siRNA转染对CFPAC-1细胞侵袭能力的影响Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面，其数量反映了细胞侵袭能力的大小。Boyden小室结果显示，与对照组比较，TROP-2siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降，且呈浓度依赖性(P＜0.001)。见图 4。

图3 TROP-2基因siRNA转染对胰腺癌细胞迁移的影响

图4 TROP-2 siRNA转染对胰腺癌细胞侵袭的影响

3 讨论

TROP-2亦称为M1S1，是GA733基因家族中的一员，定位在1号染色体短臂D1S2890和D1S2801之间一个长约2.6 cm的区域上［4］。TROP-2是无内含子的基因，所编码的产物为含有323个氨基酸、35.7 kDa的蛋白质，被认为是一种肿瘤相关抗原，其包含一个上皮生长因子样的重复区，一个甲状腺球蛋白样重复区，其分子羟基端含有丝氨酸和酪氨酸位点及PIP-2结合区域，其丝氨酸残端为激酶C所磷酸化。许多学者发现，TROP-2基因在许多实体瘤如大肠癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等肿瘤中高表达［5-7］，且其高表达与侵袭有关［8-10］。由此提示，TROP-2基因是一种有价值的治疗靶点，但该基因在国内研究甚少。

本研究以胰腺癌CFPAC-1细胞为模型，采用TROP-2基因siRNA转染该细胞后，分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法检测，结果显示，转染组胰腺癌细胞TROP-2 mRNA和蛋白明显下调，且呈时间和浓度依赖性(P ＜0.001;P ＜0.001)。

癌细胞远处转移是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。其中细胞迁移及侵袭是关键步骤。本实验通过siRNA下调胰腺癌CFPAC-1细胞中TROP-2的表达，并观察对癌细胞 迁移和侵袭的影响。结果显示，TROP-2基因表达下调后，癌细胞迁移和侵袭力均明显下降，且呈浓度依赖性(P ＜0.001，P ＜0.001)。

目前尚不清楚TROP-2基因在恶性肿瘤细胞侵袭中的分子机制，相关研究也较少，有学者发现，TROP-2抗体对胞浆内钙离子水平具有一定的调控作用［11］，而蛋白激酶 C(protein kinase C)及钙离子水平在信号传导中发挥着重要作用。

综上所述，为明确TROP-2基因靶向治疗作用，有必要深入研究TROP-2基因的具体分子机制，为今后胰腺癌的诊治提供新思路。

［1］ Fong D，Moser P，Krammel C，et al.High expression of TROP2 correlates with poor prognosis in pancreatic cancer［J］.Br J Cancer，2008，99(8):1290-1295.

［2］ Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method［J］.Methods，2001，25:402-408.

［3］ Fan Y，Zhang YL，Wu Y，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells［J］.World J Gastroenterol，2008，14(3):428-434.

［4］ Tsujikawa M，Kurahashi H，Tanaka T，et al.Identification of the gene responsible for gelatinous drop-like corneal dystrophy［J］.Nat Genet，1999，21(4):420-423.

［5］ Ohmachi T，Tanaka F，Mimori K，et al.Clinical significance of TROP2 expression in colorectal cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12(10):3057-3063.

［6］ Huang H，Groth J，Sossey-Alaoui K，et al.Aberrant expression of novel and previously described cell membrane markers in human breast cancer cell lines and tumors［J］.Clin Cancer Res，2005，11(12):4357-4364.

［7］ Nakashima K，Shimada H，Ochiai T，et al.Serological identification of TROP2 by recombinant cDNA expression cloning using sera of patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Cancer，2004，112(6):1029-1035.

［8］ Coldren CD，Helfrich BA，Witta SE，et al.Baseline gene expression predicts sensitivity to gefitinib in non-small cell lung cancer cell lines［J］.Mol Cancer Res，2006，4(12):521-528.

［9］ Mühlmann G，Spizzo G，Gostner J，et al.TROP2 expression as prognostic marker for gastric carcinoma［J］.Clin Pathol，2009，62(2):152-158.

［10］ Wang JB，Day R，Dong YY，et al.Identification of Trop-2 as an oncogene and an attractive therapeutic target in colon cancers［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(2):280-285.

［11］ Ripani E，Sacchetti A，Corda D，et al.Human Trop-2 is a tumor-associated calcium signal transducer［J］.Int J Cancer，1998，76(5):671-676.