大黄酸对慢性移植肾肾病大鼠转化生长因子β1、结缔组织生长因子和纤维连接蛋白的影响

殷立平 苏 健 张 鑫 李必波 仇莹莹 刘 丽 李 慧 熊宁宁

肾间质纤维化、肾小管萎缩是常伴随慢性移植肾肾病(CAN)出现的组织学改变［1］。尽管目前采用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素受体拮抗剂(ARB)治疗CAN大鼠取得满意结果，但临床尚无特异性的治疗方法［2，3］。

大黄酸属单蒽核类l，8-二羟基蒽醌衍生物，具有较广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗菌及抗纤维化作用［4，5］。大黄酸可降低糖尿病大鼠尿蛋白排出量，减轻肾脏肥大，缩小肾小球系膜区的面积，减小肾小球体积，降低肾小球转化生长因子β1(TGF-β1)的表达［6］;在输尿管梗阻大鼠模型中，其亦能减轻肾小管损害和肾间质纤维化，减少肾组织TGF-β1表达［7］。本研究拟通过观察大黄酸对大鼠CAN的疗效及致纤维化因子的影响，为临床治疗提供新的途径。

材料与方法

模型建立 F344近交系大鼠为供体、Lewis近交系大鼠为受体，体重170～250g，均为雄性(上海实验动物中心提供，SPF动物房饲养)。HC-A离体肾保存液(上海中心血站)灌注保存，大鼠左肾原位异体移植，术后10 d切除受体右肾。从受体肾移植术当天开始，腹腔注射青霉素20万单位/d，连续3d，环孢素口服液(杭州中美华东制药)灌胃10 mg/(kg·d)，连续 10d。

实验分组与设计 将30只肾移植大鼠分为模型组(n=16)和大黄酸治疗组(n=14)。另以5只Lewis大鼠作为对照组，行右肾切除。

大黄酸由中国药科大学提供，经高效液相色谱法(HPLC)检验药物纯度在92%以上，使用前用0.5%羧基纤维素钠生理盐水配制成相应浓度的悬液。治疗组每日固定时间以灌胃给药方式给予大黄酸［100 mg/(kg·d)］;模型组及对照组以0.5%羧基纤维素钠生理盐水灌胃，共给药4月。

标本留取

血、尿标本 肾移植成功及药物治疗开始后，每月收集24h尿和血标本。尿标本采用金属代谢笼收集后记录尿量并取10 ml 5 000 r/min离心10 min去除沉渣并分装，-20℃冰箱保存。血标本以玻璃毛细管(直径1.0 mm)经大鼠眶后静脉丛采取，6h内离心，分离血清并于-20℃冰箱保存待测。

肾组织标本 术后2月宰杀两组大鼠均取左肾组织;术后4月宰杀各组剩余大鼠。肾组织经甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约2 μm，行 HE、PAS、Masson染色;余肾组织置于液氮中保存。

实验室检查

一般指标 每月定期检测尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)、血尿素氮、血胱抑素。

肾组织病理 采用Banff 2009分类［8］，将肾小管萎缩(ct)、间质纤维化(ci)及间质炎症(i)分别积分(0，1，2，3)。

肾组织TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)和纤维连接蛋白(FN)表达及定量分析 采用常规免疫组化法，分别观察肾组织TGF-β1、CTGF和FN表达，并行半定量评分:0分:微弱染色或不染色;1分:阳性面积＜25%;2分:阳性面积25% ～50%;3分:阳性面积50% ～70%;4分:阳性面积＞70%。每张切片观察10个视野并计算平均得分。

肾组织 TGF-β1、CTGF、FN mRNA 表达 采用RT-PCR法。取液氮冻存肾组织，Trizol法提取RNA(Invitrogen，所有操作按说明书进行)，按照逆转录试剂盒(Promega)操作要求进行。β肌动蛋白(β-actin)引物:Forward Primer:5’-CCGTAAAGACCTCTA TGCCAACA-3’;ReversePrimer:5’-CGGACTCATCGTACT CCTGCT-3’;TGF-β1 引物:Forward Primer:5’-GAGAGCC CTGGATACCAACTACTG -3’，ReversePrimer:5’-GTGTGTCCAGGCTCCAAATGTAG-3’;CTGF 引 物Forward Primer:5’-CCGACTGGAAGACACATTTG-3’，Reverse Primer:5’-CCAGCCTGCAGAAGGTATTG-3;FN引物:Forward Primer:5’-GGGATCAAAGGAAACACAG-3’，Reverse Primer:5’-AGACGGCAAAAGAAAGCAG-3’。反应条件:95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，循环40次。所有基因均需与内参进行比对后统计。各基因相对于内参 β-actin 在不同组别中表达水平(2-ΔΔCt)用±s表示。

统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件处理数据。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。多样本比较采用One Way ANOVA分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

大黄酸对肾移植大鼠肾功能及尿蛋白的影响与正常大鼠相比，移植后大鼠SCr及尿蛋白定量明显升高。不同时期大黄酸治疗组大鼠移植肾功能变化不大，但与同期模型组大鼠相比，各项指标皆优于模型组(表1)。

大黄酸对肾移植大鼠肾脏病理的影响 2月时大黄酸治疗组大鼠肾间质炎症较模型组轻，肾小管萎缩及间质纤维化与模型组无明显差异;4月时大黄酸治疗组大鼠肾间质纤维化较模型组明显改善，两组间存在显著差异(P＜0.01);间质炎症亦较模型组轻(表2)。

大黄酸对 CAN 大鼠肾组织 TGF-β1、CTGF、FN蛋白质表达水平的影响 对照组大鼠肾脏组织切片免疫组化染色仅见少量肾小管上皮细胞胞质或间质区域表达CTGF、TGF-β1及FN。大黄酸治疗组及模型组大鼠CTGF主要表达于肾间质区域，大黄酸治疗2月时，两组大鼠肾组织CTGF表达无明显差异;大黄酸治疗4月时，治疗组肾组织CTGF表达明显低于模型组。TGF-β1主要表达于肾小管上皮细胞胞质、胞膜、部分肾小球系膜区及管周毛细血管壁。半定量分析显示，大黄酸治疗组与模型组相比无显著差异;FN表达以肾小管间质区域为主，少量表达于肾小球系膜区。统计学分析显示，术后4月时，大黄酸治疗组FN表达明显低于模型组(表3)。

表1 大鼠肾移植术后肾功能及尿蛋白定量变化

表2 大鼠肾移植术后肾脏组织学改变

大黄酸治疗不同时期对CAN大鼠肾组织TGF-β1、CTGF、FN mRNA表达的影响 模型组及大黄酸治疗组大鼠肾组织TGF-β1 mRNA的表达随着病程的进展而升高，但两组间不同时期无明显差异;两组CTGF mRNA的表达在术后2月时无明显差异，但4月时大黄酸组CTGF mRNA的表达明显低于模型组，两组间比较存在显著差异。模型组及大黄酸治疗组大鼠肾组织FN mRNA的表达随着病程的进展而升高，不同时期大黄酸组大鼠肾组织FN mRNA的表达要低于模型组，于4月时大黄酸治疗组大鼠肾组织FN mRNA的表达要显著低于模型组，两组比较有统计学差异(表4)。

表3 大黄酸对CAN大鼠肾组织CTGF、TGF-β1、FN表达的影响

表4 不同时期大黄酸治疗对CAN大鼠肾组织CTGF、TGF-β1、FN mRNA表达的影响

讨 论

1993年，Dennis等［9］采用 Fisher 344 和 Lewis两种近交系大鼠建立了标准的CAN模型，是目前世界公认研究CAN的最佳模型之一。本研究利用显微外科技术进行F344-Lewis大鼠左肾原位移植，术后进行功能检测发现移植组蛋白尿增加、SCr升高;肾脏组织学表现为间质纤维化，间质大量炎症细胞浸润，肾小球基膜增厚、硬化，毛细血管袢闭塞，肾小管萎缩退化;RT-PCR检测显示细胞外基质胶原Ⅰ、Ⅲ及FN mRNA含量明显增加。实验数据表明，本研究已成功复制出类似于人类CAN的大鼠模型。

肾脏纤维化在慢性肾脏病进展为终末期肾功能衰竭中有重要作用，其机制主要涉及三个环节:(1)炎症细胞浸润、肾固有细胞增生、凋亡及表型转化;(2)致纤维化因子，如TGF-β1、CTGF及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等表达上调;(3)细胞外基质的积聚与降解失衡［10］。

本研究在建立大鼠CAN模型的基础上，首次观察大黄酸对CAN的治疗作用。结果显示，大黄酸治疗早期即可改善CAN大鼠肾功能，炎症细胞浸润及肾间质纤维化明显改善，FN沉积明显低于对照组。

本研究观察到不同时期大黄酸治疗组肾组织炎细胞浸润要明显轻于模型组。尤其术后8周，两组大鼠间质损伤主要表现为炎症细胞浸润，间质纤维化改变相对较轻，此时大黄酸治疗组炎细胞浸润即明显减轻，提示大黄酸具有抗炎作用。赵琪等［11］研究发现，大黄酸能抑制内毒素，诱导巨噬细胞白细胞介素12(IL-12)mRNA过度表达，且能使细胞内钙离子内流降低，表明大黄酸能通过抑制细胞内信号传递的强度达到抑制大鼠腹腔巨噬细胞IL-12 mRNA表达的目的。倪虹等［12］研究显示，大黄酸对小鼠腹腔巨噬细胞内白三烯C4、B4的生物合成具有较强的抑制作用，并能提高巨噬细胞内cAMP水平，抑制其花生四烯酸代谢，同时可显著抑制内毒素刺激引起的细胞内钙增加。炎症细胞浸润是肾脏纤维化的启动因素，阻断其发生及发展必然可阻止肾脏纤维化的进展。这可能是大黄酸抗肾脏纤维化的机制之一。

TGF-β1是最主要的致纤维化因子。作为TGF-β1的下游效应因子，CTGF介导了TGF-β1部分生物学功能(如促进纤维细胞增生及细胞外基质产生)。因此，两者皆与肾脏纤维化密切相关。

我们首先观察了大黄酸对TGF-β1及CTGF的影响，结果显示无论蛋白质还是基因水平，大黄酸皆不影响TGF-β1的表达。该结果与以往结果不同。既往研究显示，大黄酸可抑制输尿管梗阻模型大鼠［7］、糖尿病肾病大鼠［13］及肝脏纤维化大鼠模型［14］肾脏及肝脏组织中TGF-β1的表达，并提出大黄酸为延缓组织纤维化的主要原因。本研究的结果与之不同的原因尚不清楚，但值得注意的是，我们观察到大黄酸可明显抑制CAN大鼠模型移植肾组织中CTGF的表达。

TGF-β1诱导CTGF表达的机制可能和TGF-β1反应元件及Smads蛋白的活化有关，在多种细胞的CTGF启动子序列的-162和-128位点之间存在特异性的 TGF-β1 反应元件(TβRE)，它是 TGF-β1 诱导CTGF表达所不可少的。因此大黄酸是否通过对TGF-β1反应元件及Smads蛋白活化的影响而特异性地抑制CTGF的表达，值得我们进一步研究。

本研究初步结果显示，大黄酸可通过抑制炎症细胞浸润、抑制致纤维化因子CTGF等途径对抗CAN大鼠肾间质纤维化，改善肾功能及肾组织慢性病变。

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6 郭啸华，刘志红，戴春笋，等.大黄酸抑制 TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞肥大及细胞外基质产生.肾脏病与透析肾移植杂志，2001，10(2):101-105.

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10 Eddy AA.Molecular basis fibrosis.Pediatr Nephrol，2000，15(3-4):290-301.

11赵 琪，崔乃强，张立冬.内毒素诱生大鼠腹腔巨噬细胞IL-12 mRNA表达调控及大黄酸对其作用研究.中国中西医结合外科杂志，1998，4(1):1-4.

12倪 虹，李继坤，房 洁，等.大黄酸对肿瘤坏死因子α所致胰腺细胞损伤的保护作用.中国中西医结合消化杂志，2001，9(3):139-140.

13龚 伟，黎磊石，孙 骅，等.大黄酸对糖尿病大鼠转化生长因子β及其受体表达的影响.肾脏病与透析肾移植杂志，2006，15(2):101-110.

14万晓强，郑紫丹，尚军洁，等.大黄酸对免疫性肝纤维化大鼠形成的影响.重庆医学，2009，38(10):1204-1206.