[4（-4-氟苯基）-6-异丙基-2（-N-甲基-N-甲磺酰基氨基）嘧啶-5-基]甲醇含量测定和有关物质检查

谢春燕，徐新军，刘群娣，闫李丽，谢晓玲（.中山大学药学院，广州市50006；.广州中一药业有限公司，广州市 50000）

瑞舒伐他汀钙（Rosuvastatin calcium）为新型的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG CoA）还原酶抑制剂[1]，是第7个进入市场的他汀类药物，是迄今为止最强效的降脂药物，被誉为“超级他汀”[2]，主要用于治疗高脂血症和高胆固醇血症[3]。

[4-（4-氟苯基）-6-异丙基-2-（N-甲基-N-甲磺酰基氨基）嘧啶-5-基]甲醇（以下中文名均简称为瑞舒伐他汀中间体Ⅵ，英文名为Rosuvastatin intermediateⅥ），是中山大学药学院合成瑞舒伐他汀钙改进工艺时的第6步反应的产物中间体[2]。药物合成中间体是合成原料药的重要物质，其质量直接决定了原料药和最终成品的质量和疗效，因此有必要对药物合成中间体进行质量控制。在合成瑞舒伐他汀钙时，该中间体反应时技术难度较高，比较容易引入杂质，而其他中间体合成过程相对比较简单，容易获得高纯度的产品。所以该中间体的纯度和杂质含量直接决定后续的合成工作与最终产品的质量，研究该中间体的含量测定方法和有关物质含量测定方法可考察合成路线是否可行。目前有关瑞舒伐他汀中间体Ⅵ质量标准研究的文献报道仅有其残留溶剂测定[4]，本文建立了瑞舒伐他汀中间体Ⅵ含量测定及其有关物质检查的高效液相色谱（HPLC）分析方法，对有效地控制瑞舒伐他汀钙成品的质量具有十分重要的意义。

瑞舒伐他汀中间体Ⅵ及瑞舒伐他汀钙的化学结构式见图1。

1 仪器与试药

1525型HPLC仪、2996型二极管阵列检测器、717型自动进样器（美国Waters公司）；Mettler Toledo AG285十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

图1 瑞舒伐他汀中间体Ⅵ和瑞舒伐他汀钙的结构式Fig 1 Formula structure of rosuvastatin intermediateⅥand rosuvastatin calcium

瑞舒伐他汀中间体Ⅵ对照品（批号：081229，含量：99.88%）；瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品（批号：090109、090110、090111）；瑞舒伐他汀中间体 Ⅰ（批号：081213）、中间体Ⅱ（批号：081216）、中间体Ⅲ（批号：081218）、中间体Ⅳ（批号：081221）、中间体Ⅴ（批号：081225）、中间体Ⅶ（批号：081228）均由中山大学药学院制备；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，水为超纯水。

2 瑞舒伐他汀中间体Ⅵ含量测定

2.1 色谱条件

色谱柱：Grace-Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氢钠溶液（57∶43）；检测波长：235 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱温：25 ℃；进样量：20 µL。

2.2 系统适用性试验

取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ对照品适量，加甲醇-水（80∶20）溶解制备为浓度约为500µg·mL－1的对照品溶液；取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品适量，加甲醇-水（80∶20）溶解制备成浓度约为500µg·mL－1的样品溶液；另取瑞舒伐他汀合成中间体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ适量，分别加甲醇-水（80∶20）制备成浓度约为250µg·mL－1的溶液；取瑞舒伐他汀中间体Ⅱ适量，制备为浓度约为40µg·mL－1的溶液。分别取上述瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品溶液和瑞舒伐他汀中间体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ溶液适量，混合均匀，得瑞舒伐他汀中间体Ⅰ～Ⅶ混合样品溶液。

取瑞舒伐他汀中间体Ⅰ～Ⅶ混合样品溶液、对照品溶液、瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品溶液进样分析，结果，以瑞舒伐他汀中间体Ⅵ峰计理论板数不低于3 000，各峰分离度大于1.5。二极管阵列检测器检查主峰色谱纯度角为0.038，阈值为0.307，前者小于后者，表明纯度符合规定。色谱见图2。

图2 系统适用性高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of system suitability

2.3 专属性试验

取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品分别进行酸（1 mol·L－1的盐酸甲醇溶液）、碱（1 mol·L－1的氢氧化钠甲醇溶液）、氧化（3%的双氧水）、高温（取样品固体少量，电炉加热至约200℃）、光照（红外照射7 h，光照强度约2 000 lx）破坏试验，各破坏后样品分别加入甲醇-水（80∶20）稀释为500 µg·mL－1的供试液。分别精密吸取上述供试液各5µL，注入液相色谱仪，记录色谱至主峰保留时间的2.5倍。结果，酸、碱、氧化、高温及光照破坏后的降解产物与主成分有很好分离，详见图3。

图3 破坏试验高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of destruction tests

2.4 线性范围

取浓度为260.79 µg·mL－1的对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25、30µL。以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为y＝994 891x－111 953（r＝0.999 9），瑞舒伐他汀中间体Ⅵ检测浓度的线性范围为65.20～391.18 µg·mL－1。

2.5 回收率试验

精密量取5 mL已知浓度（256.76µg·mL－1）的样品溶液（批号：090111）3份于25 mL容量瓶中，分别加入4、5、6 mL对照品溶液（浓度为260.79 µg·mL－1），加甲醇-水（80∶20）稀释至刻度，平行操作2份。按“2.1”项下条件测定，低、中、高3个浓度回收率分别为99.16%、98.73%、100.59%，RSD分别为0.59%、0.67%、1.06%。

2.6 重复性试验

进样重复性试验：取对照品溶液重复进样6次，每次20µL，记录峰面积，RSD为0.23%。

样品测定的重复性：取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品（批号：090110）6份，精密称定，按“2.2”项下样品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算含量平均值为99.48%，RSD为0.69%。

2.7 样品溶液稳定性试验

取同一份瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品溶液（批号：090109，浓度：251.58 µg·mL－1），分别于制备后8 h内每隔一段时间进样1次，记录峰面积。结果，RSD为0.53%，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.8 样品含量测定

称取3批瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品（批号：090109、090110、090111）各2份，精密称定，制备为样品溶液。按“2.1”项下色谱条件，同时取对照品溶液和样品溶液注入色谱仪，按外标法计算含量，结果见表1。

3 有关物质检查

3.1 色谱条件

色谱柱：Grace-Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动

表1 样品中主成分和有关物质含量测定结果Tab 1 Content determination of main component and its related substances in samples

3.2 有关物质检查方法

取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ对照品适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）溶解，得浓度为253.90 µg·mL－1的对照品溶液A。精密量取1 mL对照品溶液A，至100 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）稀释得浓度为2.54 µg·mL－1的对照品溶液B（即1%的对照品溶液A）。取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品62.5 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）溶解得浓度约为1 250 µg·mL－1的样品贮备溶液。精密量取5 mL样品贮备溶液至25 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）稀释得浓度约为250µg·mL－1的样品溶液。取对照品溶液B、样品溶液分别进样20 μL。

3.3 线性关系考察

取浓度为2.371 μg·mL－1的对照品溶液（相当于样品溶液的1%），分别进样2、5、10、20、40 μL。以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为y＝51 293x－3 642.4（r＝0.999 5），表明有关物质的检测浓度线性范围为0.24～4.75 μg·mL－1。

3.4 定量限和检测限

根据定量限和检测限试验方法进行操作，结果有关物质的检测限为195.8 ng·mL－1，定量限为587.5 ng·mL－1。

3.5 重复性试验

称取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品（批号：090110）6份，精密称定，按“3.2”项下操作，照“3.1”项下色谱条件测定并计算有关物质的含量。结果，有关物质含量分别为0.17%、0.18%、0.17%、0.18%、0.17%、0.18%，RSD为0.20%。

3.6 样品中有关物质含量测定

称取瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品（批号：090109、090110、090111）每批各2份，精密称定，按“3.1”和“3.2”项下方法操作，采用主成分自身稀释对照法[5]计算有关物质的含量，结果见表1。

4 讨论

4.1 色谱条件的选择

4.1.1 波长选择。采用二极管阵列检测器对瑞舒伐他汀中间体Ⅵ在200～400 nm波长内进行光谱扫描，发现在235 nm波长处有强吸收峰，所以选择235 nm作为含量测定的检测波长。经扫描，样品在220 nm波长处杂质峰有明显吸收，且基线噪音不大，故选用220 nm作为有关物质含量测定的检测波长。

4.1.2 流动相选择。大多数瑞舒伐他汀合成中间体呈弱酸性，考虑用缓冲盐作为流动相，参考相同他汀类药物测定的色谱条件，决定采用0.025 mol·L－1的磷酸二氢钠溶液[6]（pH＝4.7）。首先以乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氢钠（40∶60）为流动相，测定瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品溶液，结果主峰保留时间过长；后调整乙腈为60%，结果主成分在9.6 min出峰；另选择甲醇-水（70∶30）为流动相，取瑞舒伐他汀中间体Ⅰ～Ⅶ混合样品溶液进样，结果峰形重叠而且拖尾；又采用乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氢钠（60∶40），取混合样品溶液进样，结果在9～10 min时有3个峰明显重叠；最后流动相调整为乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氢钠（57∶43），结果混合样品中各峰分离较好，主峰与相邻峰分离度大于1.5，峰形好，故选用乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氢钠（57∶43）为流动相进行测定。

4.2 主成分自身稀释对照法

本品无相应杂质的对照品，且杂质含量低，不适合用面积归一化法计算杂质含量。主成分自身稀释对照法是通过稀释样品溶液作为杂质对照计算杂质含量，适用于无法得到杂质对照品的化合物的有关物质含量测定，故本文选用此法进行测定。通过考察瑞舒伐他汀中间体Ⅵ样品色谱图杂质峰情况，将杂质限量定为1%，以样品溶液的1%作为对照溶液计算样品杂质的含量（计算杂质含量时，任何小于主峰面积0.05倍的峰忽略不计）。

[1] 李玉霞，江 珊.瑞舒伐他汀的研究进展[J].心血管病学进展，2010，31（5）：585.

[2] 邵 飞，孙笑宾，魏启华.瑞舒伐他汀中间体的合成工艺改进[J].精细化工，2006，23（2）：192.

[3] 邱 畅，温预关，张 明，等.LC-MS/MS法检测人血浆中瑞舒伐他汀的浓度[J].今日药学，2010，20（4）：13.

[4] 谢晓玲，谢春燕，万金志，等.气相色谱法测定[4-（4-氟苯基）-6-异丙基-2-（N-甲基-N-甲磺酰基氨基）嘧啶-5-基]甲醇的残留溶剂[J].中国药房，2010，21（45）：4 294.

[5] 魏嘉陵，林畅伟.用加校正因子的主成分自身对照法测定苯扎贝特中杂质氯苯酪胺的含量[J].药物分析杂志，2006，26（12）：1 848.

[6] 王学军，许振良，冯建立，等.反相高效液相色谱法测定辛伐他汀及其有关物质洛伐他汀的含量[J].中国现代应用药学杂志，2007，24（5）：383.