阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类抗生素耐药基因分析

罗必蓉，刘蓉，刘继芬，唐玲，蒋宏

（成都中医药大学医学技术学院微生物学及免疫学检验教研室，四川 成都 610041）

近年来阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）已成为医院感染的重要病原菌，该菌对包括氨基糖苷类在内的常用抗生素常呈现多重耐药性，令抗菌感染治疗相当困难。为了解成都地区阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶（Aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）基因存在情况，我们对临床分离的33株阴沟肠杆菌进行了药敏实验，并检测了9种AMEs基 因：aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（3）－Ⅲ、aac（3）－Ⅳ、aac（6′）－Ⅰ、aac（6′）－Ⅱ、ant（3″）－Ⅰ、ant（2″）－Ⅰ、aph（3′）－Ⅵ，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定

33株试验菌株分离自成都地区3家医院2009年10月至2010年5月住院患者送检的各种标本，其中痰液27份、尿液4份、伤口分泌物2份。采用Bio－Merieux公司API 20E鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 药敏试验

微量肉汤法，采用美国Bio－Merieux公司产品ATB G－5药敏试验板，共测试18种抗菌药物的敏感性。

1.3 基因检测

采用聚合酶链反应（PCR）法检测AMEs基因，用蛋白酶K消化法制备DNA扩增模板。根据GenBank中已发布的AMEs基因序列自行设计引物，上海生物工程有限公司合成引物；PCR扩增引物序列及产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系 为：P1、P2 引 物 各 0.5μmol／L，KCl 10.0 mmol／L，（NH4）2SO48mmol／L，MgCl22mmol／L，Tris－HCl（pH 9.0）10mmol／L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反应体积20μl，其中模板液5μl。热循环参数为93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，共35周期；最后1个循环72℃延伸至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，伊凡思蓝（EB）染色，紫外灯下观察结果，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。PCR技术及基因检测阳性对照由本实验室筛查并经测序证实，纯水为阴性对照。

序列分析PCR产物经纯化后，送北京三博远志生物技术有限公司测序，并将测得序列与GenBank中已发布序列进行比较。

2 结果

2.1 药敏试验

本组菌株多重耐药性严重，仅对亚胺培南和厄它培南全部敏感。对氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦、头孢替坦耐药率均在90%以上。对氨基糖苷类3种抗菌药物阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐药率分别为33.3%、63.6%、81.8%（表2）。

2.2 9种AMEs基因PCR检测

9种 AMEs基因阳性率：aac（6′）－Ⅰ、ant（3″）－Ⅰ、aac（3）－II、ant（2″）－Ⅰ、及 aph（3′）－Ⅵ的阳性率分别为：87.8% （29／33）、63.6% （21／33）、54.5%（18／33）、45.4%（15／33）、24.2%（8／33），而aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅲ、aac（3）－IV、aac（6′）－II基因均未检出。

表1 氨基糖苷类修饰酶基因PCR引物序列及产物长度Tab.1 Primers sequences and products length of aminoglycosides modifying enzymes

表2 33株阴沟肠杆菌对18种抗生素的敏感性（株，%）Tab.2 The sensibility of 33strains of E.cloacae.for 18antibiotic

其中26株同时检出2种及2种以上AMEs基因阳性，6株仅1种基因阳性，其余1株未检出任何1种基因。氨基糖苷类抗生素敏感性与基因检测结果相关情况：27株对氨基糖苷类抗生素耐药菌株中至少存在1种AMEs基因；6株对氨基糖苷类抗生素敏感菌株中，有2株检测出AMEs基因阳性。本研究对aac（6′）－Ⅰ 、ant（3″）－Ⅰ、aac（3）－II、ant（2″）－Ⅰ、及aph（3′）－ⅥPCR阳性产物各随机抽取1株测序，并与GenBank中发布的序列做比较，结果一致。图1为部分AMEs基因PCR产物电泳图。

图1 部分AMEs基因PCR产物电泳图Fig.1 PCR product electrophoretogram of some AMEs

3 讨论

阴沟肠杆菌是肠杆菌科中具有代表性的细菌，可从尿液、痰液、脓液、血液和脑脊液中分离出来。中国医院内病原菌耐药监测网资料显示，阴沟肠杆菌已成为近年来医院感染的重要病原菌［1］。该菌的临床检出率仅次于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌而位居第3位，且有逐年上升的趋势。本研究中从痰液分离的阴沟肠杆菌占被检菌株总数的81.8%。

阴沟肠杆菌耐药株的增多及其耐药率的攀升日趋严重，使抗感染治疗十分困难，甚至导致临床治疗失败。本研究菌株药敏结果表明，阴沟肠杆菌具有较高的耐药率，并且多重耐药情况严重。对青霉素类、1～3代头孢菌素环丙沙星、复方新诺明的耐药率在50%～90%以上，其中对头孢唑啉耐药率高达100%，对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素3类氨基糖苷类抗生素的耐药率分别为33.3%、63.6%、81.8%。只对亚胺培南和厄它培南全部敏感，可见对于阴沟肠杆菌，体外活性最好的为碳青酶烯类抗生素。

阴沟肠杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药是通过产氨基糖苷类修饰酶、细菌16SrRNA甲基化酶、和氨基糖苷类作用靶位16SrRNA基因突变及核糖体蛋白编码基因突变所致［2］。产氨基糖苷类修饰酶是其耐药的主要原因。目前，国内外有关阴沟肠杆菌产AmpC酶、TEM、SHV和CTX－M等类型内酰胺酶的研究方面有较多报道［3，4］，但产氨基糖苷类修饰酶的研究报道甚少［5］，编码AMEs的基因有30多种，但在革兰阴性菌中常见的为9种，不同种类的AMEs可使细菌对同一种抗生素耐药，一种AMEs可使数种氨基糖苷抗生素活性下降，形成交叉耐药［5］。

本研究中AMEs基因阳性率较高的分别是aac（6′）－Ⅰ 87.8% （29／33）、ant（3″）－Ⅰ63.6% （21／33）、aac（3）－II 54.5%（18／33），97%菌株有1种或1种以上基因。多数基因型与耐药表型结果相符，但也有少数不相符的，如6株对氨基糖苷类抗生素敏感菌株中，有2株检测出AMEs基因阳性，可能与基因不表达或表达不完全有关，有待于进一步研究。

本研究表明，阴沟肠杆菌多重耐药严重，应进一步加强其耐药性监测和耐药相关基因的分子流行病学研究，以利于科学制定抗感染治疗方案，控制多重耐药菌株的播散。

［1］陈民钧，王辉.中国重症监护病房革兰阴性细菌耐药性连续7年监测研究［J］.中华医学杂志，2003，83（5）：375.

［2］蔡培泉，过毅.阴沟肠杆菌耐药相关基因国内5年（2003－2007）研究进展［J］.世界感染杂志，2008，8（4）：260.

［3］吴伟元，陈民钧.阴沟肠杆菌ampD基因突变与去阻遏持续高产 AmpC酶［J］.中国抗感染化疗杂志，2001，1（2）：65.

［4］佘丹阳，刘又宁.AmpC酶和超广谱β－内酰胺酶在阴沟肠杆菌中的表达及对其耐药性的影响［J］.中华医学杂志，2002，82（19）：1355.

［5］黄支密，糜祖煌，秦玲，等.20株阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因型分析［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25（5）：428.