野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠肺功能及自由基水平的影响

黄 勇 苏 韫 明海霞 颜春鲁 薛 娜 (甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000)

本实验通过现代制剂工艺技术提取野菊花有效成分，以小剂量脂多糖复制慢性支气管炎(CB)大鼠模型，观察野菊花提取物对各组大鼠肺功能、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级Wistar大鼠，48只，体重(200±20)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验中心提供，动物实验设施使用证号:SYXK(甘)2004-0006-0000135，实验动物质量合格证号:SCXK(甘)2004-0006-0000401。

1.2 药物与试剂 精制脂多糖，购自美国Sigma公司;野菊花提取物:野菊花购自甘肃中医学院附属医院，提取物由甘肃中医学院中药制剂教研室协助提取制备;SOD、MDA、NO测试盒，南京建成生物工程研究所提供(批号20080424);喘息灵胶囊，厦门星鲨制药有限公司，批号:070101;其他试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器 FA-2004N型电子天平(上海精密科学仪器机械有限责任公司天平制造厂)，VIS-7220分光光度仪(北京瑞利分析仪器厂)，HH.SH.CV2型电热恒温水浴锅(济南医疗器械厂);BioLap-420F生物信号分析系统、张力传感器:成都泰盟生物科技公司出品。

1.4 动物分组及动物模型的制备 48只Wistar大鼠，随机分为6组:空白对照组，CB模型组，喘息灵对照组，野菊花提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组8只。各组大鼠腹腔注射乌拉坦(1.4 g/kg)麻醉后，仰卧位固定于操作台，常规消毒，纵向切开颈部，分离皮下，暴露气管，4号针头穿刺气管，正常对照组气管注入生理盐水200 μl，其余注入1 g/L的脂多糖 200 μl建立CB模型〔1，2〕;第8天起，正常对照组、CB模型组每日灌服等体积生理盐水，中药对照组灌服喘息灵胶囊0.13 g·kg－1·d－1，野菊花治疗组低、中、高剂量组分别灌胃野菊花提取物0.7，1.4，2.8 g·kg－1·d－1，共 21 d。

1.5 血清及肺组织匀浆的制备 各组动物按上述方法给药后，第22天各组大鼠股动脉取血分离血清待检。按上述方法给药后，将制备病理切片后左侧剩余肺组织，用冰冷生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入10 ml的小烧杯内。用量筒量取预冷的0.86%生理盐水(总量相当于每个组织重量的9倍)，用移液管取2/3 0.86%生理盐水于烧杯中，用眼科小剪剪碎组织块(小烧杯置于冰水中)。将剪碎的组织块倒入玻璃匀浆器中，再将剩余的1/3 0.86%生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行匀浆，上下转动研磨6 min，充分研碎，使组织匀浆化，即可制成10%组织匀浆。将匀浆以3 000 r/min离心10 min，取上清液进行标本测定。

1.6 指标观察

1.6.1 呼吸功能检测 药物灌胃21 d后，大鼠称体重用20%的乌拉坦10 ml/kg腹腔内注射麻醉，待完全麻醉后，将大鼠背位固定于手术台上，颈部正中切口，钝性分离气管前组织，暴露气管，于甲状软骨下方做倒“T”型切口，插入“Y”型气管插管并固定，Y型气管插管一端经张力换能器与BioLap-420F生物信号采集系统相连，选择呼吸功能检测模块，30 Hz滤波，时间常数0.1 s，速度1 mm/s，待呼吸平稳后自动描记呼吸曲线并读取相关指标，描记15 min后保存。在所描记呼吸曲线的开始端，中部，尾部各截取三段，测定各段的呼吸频率，最大呼气幅度(曲线向上的峰值)，最大吸气幅度(曲线向下的峰值)。分别取其平均值即为该鼠的呼吸频率，最大呼气幅度，最大吸气幅度。据其最大呼气幅度与最大吸气幅度，计算呼吸气幅度比。

1.6.2 SOD、MDA、NO的检测 用黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠血清及组织中的SOD水平;用硫代巴比妥酸法(TBA)测定各组大鼠血清及组织中的MDA含量;考马斯亮蓝法测定组织中蛋白含量，用硝酸盐还原酶法测定血清及各组织中的NO含量，具体步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 野菊花提取物对大鼠呼吸功能的影响 模型组大鼠呼吸频率、最大呼气幅度、最大吸气幅度、呼吸气幅度比都比空白对照组明显改变(P＜0.01)，呼吸频率加快，最大呼气幅度减小，最大吸气幅度加深，说明造模成功。经野菊花提取物治疗后，各治疗组呼吸频率减慢，最大呼气幅度增加，最大吸气幅度变浅，呼吸功能明显改善(P＜0.01，P＜0.05)。见表1。

表1 野菊花提取物慢支大鼠呼吸功能检测的影响(±s，n=8)

表1 野菊花提取物慢支大鼠呼吸功能检测的影响(±s，n=8)

与空白对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

NS 92±17 9.08±1.57 3.30±0.62 2.75±0.70模型组 等体积NS 115±201) 4.50±0.761) 6.00±0.541) 0.75±0.181)喘息灵对照组 0.13 98±162) 8.00±2.022) 3.46±0.772) 2.31±0.902)野菊花低剂量组 0.7 100±162) 8.00±1.062) 3.96±0.682) 2.02±0.482)野菊花中剂量组 1.4 106±203) 7.64±1.002) 4.10±0.82) 1.86±0.792)野菊花高剂量组 2.8 110±253) 6.70±1.763) 4.60±0.912) 1.45±0.933)呼吸气幅度比空白对照组 等体积组别 剂量(g·kg－1·d－1) 呼吸频率(次/min) 最大呼幅(μV) 最大吸幅(μV)

2.2 野菊花提取物对大鼠血清及肺组织匀浆SOD含量变化的影响 模型组大鼠血清和肺组织中的SOD活力与空白对照组比较明显降低(P＜0.05)，野菊花提取物低剂量组大鼠肺组织中SOD活力与模型组比较无显著性差异，其余各组与模型组比较，大鼠血清和肺组织中的SOD活力均明显升高(P＜0.05)，且高剂量组与低剂量组比较有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.3 野菊花提取物对大鼠血清及肺组织匀浆MDA含量变化的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠血清和肺组织中的MDA水平明显升高(P＜0.05)。与模型组比较，除野菊花低剂量组血清MDA含量无显著性改变外，其余各组大鼠血清、肺组织MDA水平均明显降低(P＜0.05)。见表3。

2.4 对大鼠血清及肺组织匀浆NO含量变化的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠血清和肺组织中NO的水平明显升高(P＜0.05);与模型组比较，野菊花中、高剂量组血清和肺组织中NO含量均明显降低，有显著差异(P＜0.05)。见表4。

表2 各组血清及肺组织SOD含量(±s，n=8)

表2 各组血清及肺组织SOD含量(±s，n=8)

与空白对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05;与低剂量组比较:3)P＜0.05

组别 剂量(g·kg－1·d－1)血清(NU/ml)肺组织(NU/mgpro)NS 283.70 ±35.89 517.61 ±81.70模型组 等体积NS 137.15±24.681)315.44±79.851)喘息灵对照组 0.13 202.64±30.161)441.27±74.102)野菊花低剂量组 0.7 173.32±28.862) 396.22±84.05野菊花中剂量组 1.4 192.02±40.522)413.14±66.292)野菊花高剂量组 2.8 207.91±24.252)3)425.30±71.602)3)空白对照组 等体积

表3 各组血清及肺组织MDA含量比较(±s，n=8)

表3 各组血清及肺组织MDA含量比较(±s，n=8)

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与慢支模型组比较:2)P＜0.05

组别 剂量(g·kg－1·d－1)血清(nmol/ml)肺组织(nmol/gpro)NS 5.16±1.19 10.02 ±1.72模型组 等体积NS 10.24±3.221) 15.92±4.801)喘息灵对照组 0.13 6.75±1.742) 11.25±2.472)野菊花低剂量组 0.7 8.65±1.53 12.16±3.422)野菊花中剂量组 1.4 7.70±1.412) 11.32±2.782)野菊花高剂量组 2.8 6.75±1.262) 10.80±2.482)空白对照组 等体积

表4 各组血清及肺组织NO含量比较(±s，n=8)

表4 各组血清及肺组织NO含量比较(±s，n=8)

与空白对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 剂量(g·kg－1·d－1)血清(μmol/ml)肺组织(μmol/gpro)NS 10.17 ±2.58 1.58 ±0.47模型组 等体积NS 16.17±2.341) 4.68±0.691)喘息灵对照组 0.13 14.67±3.15 3.28±0.64野菊花低剂量组 0.7 14.92±3.34 3.10±0.47野菊花中剂量组 1.4 13.80±2.202) 2.37±0.542)野菊花高剂量组 2.8 11.28±1.782) 2.80±0.642)空白对照组 等体积

3 讨论

随着中国进入老龄化社会，以及慢支危险因素(吸烟、环境污染等)的增加，慢性支气管炎的实际患病人数将会越来越多，因此，寻找安全有效的药物对防治慢支具有十分重要的意义。本课题选用野菊花，药用历史悠久，野菊花性凉，味苦、辛，归肺肝二经，清热解毒、消散痈肿、疏风平肝之功效。分布于我国东北、西北、华北等地，野生资源比较丰富，现代医学从化学、药理及临床等方面均研究证明野菊花具有抗病原微生物感染、抗炎、抗氧化等多种生理活性〔3～5〕。

本实验呼吸功能检测结果显示:模型组大鼠较正常大鼠呼吸频率加快、且高于正常值(正常值为66～114次/min〔6〕)，最大呼气幅度显著降低，最大吸气幅度显著增加，呼吸幅度比显著减小，表明模型大鼠呼吸频率加快，呼气变浅，吸气变深，说明其存在气短，喘息，提示其气管、支气管黏膜有病变，符合慢支的特征，进一步证明本次实验造模是成功的。野菊花提取物各剂量组可以改善大鼠呼吸功能(减慢呼吸频率，增大呼气幅度，减小吸气幅度)，缓解其气短，呼吸困难症状，作用强度方面，以大、中剂量为优。其改善呼气功能的作用机制与其改善大鼠肺部损伤、抗炎、抗氧化有密切关系。

本实验结果表明，采用脂多糖复制的大鼠模型由于缺氧和慢性炎症，细胞耗氧量明显增加，体内产生大量自由基，其血清、肺组织中MDA、NO含量较正常组明显升高，SOD活力显著下降(P＜0.05)，脂质过氧化反应增强。而肺部慢性炎症又使得机体抵抗力降低，抗自由基能力减弱，抗氧化能力下降，加剧了细胞坏死和组织损伤，致使病情进一步加重，肺功能进一步减退。通过模型组与正常组的结果比较显示，这些变化可能是慢支发生、发展的重要机理之一。而经野菊花提取物治疗后，SOD水平显著提高，MDA、NO含量明显降低(P＜0.05)，这与文献报道野菊花提取物具有抗氧化作用是相符的，表明野菊花提取物确具有降低脂质过氧化反应，减轻氧自由基损伤，保护肺组织的作用。

本课题前期已通过实验证明，野菊花提取物可以改善肺组织的病理损伤，降低慢支大鼠体内TNF-α、IL-6水平及PMN的吞噬功能和呼吸爆发强度〔7，8〕，以上各方面均有可能是野菊花提取物减轻CB炎症效应的机制。

1 马 楠，崔德建，梁延杰，等.气管内注入脂多糖法建立大鼠慢性支气管炎模型〔J〕.中华结核和呼吸杂志，1999;6(22):371-2.

2 唐光华，黄启福，姜良铎，等.艾麻口服液对慢性支气管炎模型大鼠气道病理损伤的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2002;25(5):26-9.

3 刘建萍.中药野菊花的研究概况〔J〕.天津药学，2007;19(4):66-8.

4 任爱农，王志刚，卢振初，等.野菊花抑菌和抗病毒作用实验研究〔J〕.药物生物技术，1996;6(4):241-4.

5 张骏艳，张 磊，金 涌，等.野菊花总黄酮抗炎作用及部分机制〔J〕.安徽医科大学学报，2005;40(5):405-7.

6 郝光荣.实验动物学〔M〕.第2版.上海:第二军医大学出版社，2005:114.

7 苏 韫，黄 勇，李 娟，等.野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠TNF-α及中性粒细胞功能的影响〔J〕.中药新药与临床药理，2009;20(4):300-3.

8 黄 勇，黄亚林，苏 韫，等.野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠TNF-α、IL-6含量及肺组织病理形态学的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;18(9):2614-6.