酸洗脱血小板HLA－Ⅰ类抗原的研究*

刘相富， 邹 勇， 刘文达， 陆 英， 覃雪玲， 李 芳，廖思红， 袁 青， 刘贵莲， 林哲生， 黎结芳， 林东军，2△

(中山大学附属第三医院1输血科，2血液科，广东 广州 510630)

血小板输注是预防和治疗因血小板减少或血小 板功能缺陷引起出血的主要手段，但随着血小板制品在临床的广泛应用，产生同种免疫的几率也大大增加，从而导致血小板输注无效。血小板输注无效主要以产生人类白细胞抗原－1(human leukocyte antigen－1)HLA－Ⅰ类抗体为主，其次为血小板抗原特异性抗体(human platelet alloantigen，HPA)。病人一旦发生血小板输注无效将面临临床治疗和经济上的双重困境，因此国内外学者一直在探索预防血小板输注无效的新方法。目前国内学者已广泛开展利用多种血小板洗涤液制备洗涤血小板的研究［1，2］。洗涤血小板虽可以有效去除血小板制剂中残留的白细胞和血浆蛋白，降低了非溶血性发热反应和过敏反应的发生率，但却无法阻止血小板输注无效的发生。血小板表面HLA－Ⅰ类抗原的存在是产生HLA－Ⅰ类抗体、发生血小板输注无效的主要原因，因此如何能去除血小板表面HLA－I类抗原是制备预防输注无效血小板的关键。在此研究中，我们利用不同pH值(pH=2、3、5、7)的柠檬酸缓冲液对血小板进行酸处理，观察酸处理对血小板的活化、凋亡及聚集功能的影响。我们的研究发现柠檬酸缓冲液的pH值越低，血小板HLA－I类抗原的洗脱效率越高，但血小板的活化率和凋亡率也越高。利用pH=3的柠檬酸缓冲液0℃洗脱血小板可有效洗脱血小板表面HLA－Ⅰ类抗原，尽管血小板活化率和凋亡率显著增加，但聚集功能未受显著影响，因此可用于预防血小板输注无效。

材料和方法

1 材料

FACSCalibur流式细胞仪(BD);560CA血小板聚集仪(Chrono－Log);CD41a－APC、CD62P－PE和HLA－ABC－FITC鼠抗人单克隆抗体，IgG1－PE和IgG1－FITC鼠抗人同型对照抗体均购自BD;Annexin V细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物。

2 方法

2.1 标本留取 本研究中的血小板样本均来自广州血液中心符合机采血小板捐献标准的健康献血者，每人份血小板计数均大于2.5×1011。每次实验前将22℃振荡的血小板混匀，分出血小板2－3 mL于相连的样品袋中，然后进行体外处理。

2.2 不同pH值柠檬酸缓冲液的配置 先配置0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L柠檬酸溶液，而后按照一定体积比分别配置pH=2、3、5、7的柠檬酸缓冲液，pH计滴定微调。

2.3 pH=3的柠檬酸盐缓冲液处理血小板流程取混匀后的500 μL机采血小板悬液(约含5×108个血小板)，1500 r/min室温离心10 min后弃上层血浆，加入500 μL含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)pH=3的柠檬酸缓冲液冰上孵育10 min，林格式醋酸缓冲液洗涤，PBS重悬，细胞计数。

2.4 血小板活化检测 各取1×106柠檬酸处理前后及PBS处理后血小板，采用三色流式技术检测血小板表面HLA－Ⅰ类分子(HLA－AB)及P－选择素(selectin P，CD62P)的表达。同型对照管加入CD41a－APC、IgG1－PE及IgG1－FITC鼠抗人同型对照抗体;实验管加入 CD41a－APC、CD62P－PE和HLA－ABC－FITC抗体各20 μL，于室温闭光孵育30 min后立即上机检测。

2.5 血小板凋亡检测 各取1×106柠檬酸处理前后及PBS处理后血小板，用500 mL binding buffer重悬细胞;加入1 μL Annexin V－FITC混匀;室温避光反应10 min后立即上机检测。

2.6 血小板功能检测 处理前、PBS及不同pH值柠檬酸处理后的血小板悬液经全自动血细胞分析仪血小板计数后调整到一致浓度，加入10 μL ADP作诱导剂，终浓度为10 g/L，在560CA型全自动血小板聚集仪(Chrono－log)上进行检测，记录最大聚集率(%)。

2.7 多色流式设门及分析 先用前向散射角(forward－scattering angle，FCS)及侧向散射角(side scatter，SSC)确定待检细胞群，然后以FCS和CD41a设门确定血小板(CD41a+)，最后在血小板(CD41a+)中分析其表面HLA－ABC及CD62P的表达百分率，见图1。

3 统计学处理

应用SPSS 15.0进行统计学分析，数据以均数±标准差()表示，多组间均数的比较用单因素方差分析。

结 果

1 不同pH值柠檬酸处理后血小板HLA－Ⅰ类抗原及CD62P的表达

通过流式分析发现，相对处理前，PBS处理、pH=5和pH=7的柠檬酸缓冲液处理后的血小板表面HLA－Ⅰ类抗原表达均未见显著减少(均 P＞0.05)，CD62P表达也均未见显著增加(均 P＞0.05)。而pH=2和pH=3的柠檬酸缓冲液处理后的血小板表面HLA－Ⅰ类抗原表达均显著减少(P＜0.05)，从处理前98.8% ±1.5%分别减至8.9%±2.1%和20.0% ±7.7%，而CD62P的表达均显著增加，从处理前9.9% ±4.2%分别增至84.6% ±8.5%和45.6%±7.9%。相对pH=3的柠檬酸缓冲液处理，pH=2的柠檬酸缓冲液处理后血小板HLA－Ⅰ类抗原的清除率更高(P＜0.05)，诱导的CD62P的表达也更显著(P＜0.05)，见图2、3。

Figure 1.The schematic of multi－color flow analysis.图1 多色流式分析示意图

Figure 2.Expression of platelet HLA class－Ⅰantigens after treatment with the citric acid buffer at different pH leves..n=6.*P＜0.05 vs other groups.图2 不同pH值柠檬酸缓冲液处理后血小板HLA－Ⅰ类抗原的表达

2 不同PH值柠檬酸缓冲液处理后血小板的凋亡百分比

Figure 3.Expression of P－selectin(CD62P)on platelet after treatment with the citric acid buffer at different pH levels..n=6.*P＜0.05 vs other groups.图3 不同pH值柠檬酸缓冲液处理后血小板P－选择素(CD62P)的表达

对不同pH值柠檬酸缓冲液处理后血小板进行Annexin V染色分析，发现相对PBS、pH=5和pH=7的柠檬酸缓冲液处理，pH=2和pH=3的柠檬酸缓冲液处理均显著增加了血小板的早期凋亡率(均P＜0.05)。与pH=3的柠檬酸缓冲液处理相比，pH=2的柠檬酸缓冲液处理诱导的血小板的早期凋亡率更高(P＜0.05)，见图4。

Figure 4.The proportion of early apoptotic platelets after treatment with the citric acid buffer at different pH levels..n=6.*P＜0.05 vs other groups.图4 不同pH值柠檬酸缓冲液处理后血小板早期凋亡率

3 pH=3的柠檬酸缓冲液处理对血小板聚集功能的影响

通过血小板聚集仪测定，与处理前相比，PBS和pH=3的柠檬酸缓冲液处理后血小板的聚集率均显著下降(P＜0.05)。但相对PBS处理，pH=3的柠檬酸缓冲液处理后的血小板其聚集率并未显著下降(21.2% ±14.3%vs 16.8% ±11.0%，P ＞0.05)，见图5。

Figure 5.Effect of acid eluting HLA － classⅠantigens with the citric acid buffer at pH=3 on platelet aggregation..n=6.*P ＜0.05 vs other groups.图5 pH=3的柠檬酸缓冲液处理对血小板聚集功能的影响

讨 论

早在1989年，Kurata等［3］就发现利用 pH=3的弱酸缓冲液可以有效去除血小板表面HLA－Ⅰ类抗原，并且处理后的血小板表面糖蛋白GPⅠB和GPⅡb/Ⅲa的抗原性未见改变，血小板活力未见显著减少，聚集功能仅见轻微下降。采用流式细胞术检测血小板活化状态也是很好的方法之一［4］。之后，多位研究者开始了利用酸处理血小板治疗同种免疫难治性血小板减少患者的临床前期探索，也有几例相关的病例报道［5，6］。然而进入21世纪后，弱酸洗涤血小板这一技术的基础和临床研究就毫无进展，也鲜有相关报道。为进一步探讨这一酸洗脱技术临床运用的可行性，我们利用不同pH值(pH=2、3、5、7)的柠檬酸缓冲液对血小板进行酸处理，评价了酸洗脱血小板表面HLA－Ⅰ类抗原对血小板活化、凋亡及其聚集功能的影响。通过研究发现，(1)柠檬酸缓冲液pH值越低，血小板表面HLA－Ⅰ类抗原的洗脱率越高，但同时血小板的活化率和早期凋亡率越高;(2)pH=3的柠檬酸缓冲液洗脱血小板可有效洗脱血小板表面HLA－Ⅰ类抗原，虽然血小板活化率和早期凋亡率显著增加，但其聚集功能却未受显著影响，故利用pH=3的柠檬酸缓冲液0℃洗脱血小板HLA－I类抗原可作为预防血小板输注无效的方法进行尝试，其临床应用的可行性尚待更多的体内外研究来验证;(3)室温酸洗脱血小板显著降低了血小板糖蛋白的稳定性GPⅡb/Ⅲa(结果未显示)，故酸洗脱应在0℃条件下进行。

酸处理诱导的血小板活化和凋亡是酸洗脱血小板临床应用的最大障碍。血小板一旦活化，其储备功能就相应下降，在体内的存活率也相应下降［7－10］。我们当前的研究也证实，利用pH=3的柠檬酸缓冲液洗脱血小板显著诱导了血小板的活化和凋亡，说明酸处理本身存在血小板的损伤。但尽管如此，与PBS处理相比，pH=3的柠檬酸缓冲液处理后的血小板其聚集功能并未受到显著影响，说明酸处理后的血小板仍具备一定的体内即刻止血功能，但此产品无法满足以提高外周血血小板数量为目的的临床治疗需求。因此需要新的酸处理技术，新的血小板激活抑制剂或保护剂的应用来降低酸处理过程中对血小板的激活损伤，从而提高血小板的体内存活率。目前国内已报道将可逆性血小板激活抑制剂应用于血小板保存中的研究。刘景汉等［11］在冷冻干燥保存血小板的实验研究中利用可逆性血小板激活抑制剂组合(前列腺素E1、左旋精氨酸、植酸钠和百维利肽等)，降低了冻干血小板的CD62P表达，延长了冻干血小板的生存时间。付涌水等［12］也证实可逆性血小板激活抑制剂一氧化氮可减少体外保存血小板的活化。因此可以想象血小板激活抑制剂同样可以运用于血小板的酸处理过程中。此外加上全自动血细胞洗涤仪以及新型血小板洗涤液的运用，洗涤过程中血小板的人为激活将减少，相信不久的将来高质量、安全可靠的酸洗脱HLA血小板产品将在临床治疗中发挥重要作用。

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