人前列腺特异性膜抗原基因重组腺病毒的构建及其表达

杨明花 王 帅 田 昕 李 妍 隋承光 (中国医科大学第一附属医院肿瘤研究所，辽宁 沈阳 110001)

前列腺癌在欧美国家是最常见的男性恶性肿瘤之一，据统计，2008年美国有28 660人死于前列腺癌，同时有186 320例新增病例〔1〕，我国前列腺癌发病率也呈明显上升的趋势，尤其在老年男性人群中发病率较高〔2〕。前列腺特异膜抗原(PSMA)是一种较前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)更加敏感和特异的前列腺癌(PCa)肿瘤标记物，已成为前列腺癌研究中的热点之一〔3〕。PSMA是存在于前列腺腺上皮细胞胞膜的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌基因治疗中具有良好的靶向性〔4〕。重组复制缺陷型腺病毒作为基因治疗和蛋白表达载体，已成为基因免疫治疗研究中最为广泛的载体之一。本实验通过腺病毒 Adxsi系统构建一种能高效表达人类PSMA基因的重组腺病毒，为下一步研究用其制备树突细胞疫苗治疗前列腺癌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pCMV-SPORT6/PSMA质粒、pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒和pAdxsi腺病毒骨架质粒均由本室保存，所用限制性内切酶均购自New England Biolabs公司;T4 DNA连接酶购自晶美生物公司;CIP(Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal)酶购自promega公司;pfx DNA聚合酶购自Invitrogen公司;dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司;引物合成于上海生工生物工程技术服务有限公司;质粒小/中量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒(柱离心型)、DNA凝胶回收与纯化试剂盒 (柱离心型)均购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司;1 kb DNA ladder购自鼎国生物公司;DNA Marker DL2000为大连宝生物的TAKARA产品，兔抗人PSMA单克隆抗体购自Epitomics公司;羊抗兔二抗购自中杉公司;兔抗人β-actin多克隆抗体购自康为世纪公司。大肠杆菌DH5α超级化学感受态，HEK293细胞由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 PSMA基因片段的克隆 参照PSMA序列设计一对上下游中均含有SfiⅠ酶切位点的引物，以pCMV-SPORT6/PSMA为模板，高保真酶(pfx DNA ploymerase)进行 PCR扩增，获得PSMA基因片段。

1.2.2 pShuttle-GFP-PSMA穿梭质粒的构建及鉴定 将回收后的PSMA基因片段和腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP均用SfiⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳后，柱离心型DNA纯化试剂盒回收获得的约2.2 kb的PSMA基因片段和5.1 kb的载体DNA片段。以分子浓度比为3∶1比例，将回收后的PSMA基因与载体DNA片段用T4 DNA连接酶，于22℃下连接4 h，连接产物转化化学感受态大肠杆菌DH5 α，接种卡那霉素平板培养过夜，挑取阳性克隆扩增培养，质粒小/中量提取纯化试剂盒纯化质粒，获得重组穿梭质粒pShuttle-GFP-PSMA。分别对重组pShuttle-GFP-PSMA穿梭质粒和空载体pShuttle-CMV-EGFP进行SfiⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无PSMA基因片段。为确保重组质粒pShuttle-GFP-PSMA中插入序列及读码框架的正确性，送交上海生工进行测序鉴定。

1.2.3 重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PSMA的构建及鉴定 用I-CeuI和I-SceI双酶切处理穿梭质粒pShuttle-GFP-PSMA，跑胶回收含目的基因的片段，同时用I-CeuI和I-SceI双酶切处理pAdxsi载体，并做CIP去磷酸化处理，乙醇沉淀法回收载体，将处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA连接酶进行连接，取3 μl连接产物转化化学感受态细胞DH5α菌株，涂布到氨苄抗性固体培养基平皿，挑取若干阳性克隆菌落，接种到氨苄抗性液体培养基中培养过夜，质粒小/中量提取纯化试剂盒纯化质粒，获得重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PSMA。同法制备不含目的基因的对照重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP。用XhoI酶分别对重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PSMA和空载体pAdxsi-GFP进行酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察重组腺病毒质粒的构建是否正确。

1.2.4 重组人PSMA腺病毒的包装、扩增及纯化 用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养HEK293细胞，待细胞融合至80% ～90%时转染重组腺病毒。将鉴定正确的携带PSMA基因的腺病毒质粒用PacI限制性内切酶线性化，Lipofectamine2000介导转染HEK293包装细胞，37℃，5%CO2培养箱中孵育，7～12 d后可观察到细胞病变效应(CPE)，并可在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，收集细胞，离心后弃上清，用1 ml PBS重悬细胞，－80℃、37℃反复冻融3次，离心，收集病毒上清液。取40% ～50%上清液重新感染80%～90%的HEK 293细胞，以相同的方法反复冻融4次，收上清液，用CsCl密度梯度离心法纯化病毒，分装成小份，－80℃冻存备用。

1.2.5 重组腺病毒质粒的提取鉴定及滴度测定 取重组病毒上清 10 μl，加 2 μl蛋白酶 K(10 mg/ml)，50℃孵育 1 h，100 ℃煮沸5 min，离心后取上清2 μl做模板，PCR鉴定重组病毒。将HEK293细胞平铺于96孔板，将浓缩后的病毒贮存液按不同的稀释倍数稀释，加至293细胞培养孔中，于37℃、CO2培养箱中培养10 d，第10天于荧光显微镜下观察并计算每行出现细胞病变效应(CPE)的孔数和阳性孔的比率。按照TCID50法〔5〕的计算公式，对于100 μl样品，滴度T=101+d(s-0.5)，式中d=log10稀释度;s=各稀释度阳性孔的比率之和。将TCID50/ml转换成 pfu/ml，按以下公式计算:T=a ×10bTCID50/ml=a×10b－0.7pfu/ml。

1.2.6 PSMA蛋白的表达 将HEK293细胞按6×106/ml接种75 cm2培养瓶，细胞密度60% ～80%时，将病毒上清液以感染复数(MOI)200感染细胞，48 h荧光显微镜观察GFP表达〔6〕。同时，用细胞裂解液处理细胞，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入抗PSMA单克隆抗体和羊抗兔二抗分别按1∶2 000和1∶5 000稀释使用。化学发光法显色。

2 结果

2.1 pShuttle-GFP-PSMA穿梭质粒的鉴定 分别对重组pShuttle-GFP-PSMA穿梭质粒和空载体pShuttle-CMV-EGFP进行SfiⅠ酶切，PCR扩增鉴定，前者得到约2.2 kb和5.1 kb的两个条带，与插入的目的片段大小相一致，见图1。后者阴性克隆得到5.1 kb一条带即重组穿梭载体片段。测序鉴定后的结果与GenBank报道一致。

图1 pShuttle-GFP-PSMA鉴定结果

2.2 重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PSMA的鉴定 用XhoI酶分别对重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PSMA和空载体pAdxsi-GFP进行酶切，酶切完成后加样至1%的琼脂糖凝胶，电泳，阳性克隆有 7 条带:14 kb、11.8 kb、4.8 kb、2.66 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb，空载体有 6 条带:14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb。见图 2 和图 3。

图2 pAdxsi-GFP-PSMA酶切电泳结果

图3 pAdxsi空载体酶切电泳结果

2.3 重组人PSMA腺病毒的产生及鉴定 用PacⅠ线性化的pAdxsi-GFP-PSMA转染HEK293细胞，培养1 w后出现细胞呈空泡样病变，在荧光显微镜下见明显细胞病理效应时，提取病毒DNA，经PCR反应，电泳见2 200 bp大小目的条带。见图4。说明目的基因已重组到腺病毒基因组上。将鉴定正确的浓缩病毒液以不同比例稀释重感染HEK 293细胞，计算病毒滴度为2.0×1010pfu/ml。

2.4 重组腺病毒体外转染HEK293细胞的Western印迹测定 Ad-PSMA转染HEK293细胞后，48 h后荧光显微镜观察GFP阳性表达率约达90%。Western印迹显示，在相对分子质量100 kD有一条带，与PSMA大小基本相符(糖基化作用使其相对分子质量略大于氨基酸理论值81 kD)，而对照Ad未见PSMA表达条带。见图5，图6。

图4 重组纯化腺病毒PCR电泳图

图5 重组腺病毒体外转染HEK293细胞的Western印迹结果

图6 Ad-GFP-PSMA转染HEK293细胞48 h后结果(×100)

3 讨论

PSMA是由前列腺上皮细胞分泌的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，含有750个氨基酸，相对分子质量约为100 000。PSMA由3个结构域组成，分别为含19个氨基酸的胞内N-末端区、24个氨基酸的跨膜区和707个氨基酸的胞外区，其胞内区和胞外区有多个表位，可与多种单克隆抗体结合。与表位结合的抗体、特别是与胞外区表位结合的抗体在前列腺癌的诊断和治疗中具有重要价值。PSMA在前列腺组织、前列腺癌及其淋巴结转移灶、骨转移灶中表达呈阳性，并且仅上皮细胞呈阳性，基质细胞则为阴性;其他组织几乎无表达〔7，8〕。PSMA在癌组织中表达强度较高，其表达水平与病情进展有明显相关性，发生转移、对激素治疗不敏感的Gleason评分较高的病例表达水平明显高于病情稳定的病例〔9〕;而前列腺癌去势治疗后有55%的原发灶PSMA表达增加，继发灶则100%表达增加。因而可以认为，对于前列腺癌尤其是恶性程度较高、激素治疗不敏感和转移癌，PSMA是一种有效的基因治疗靶位〔10，11〕。本文据此构建了含PSMA基因序列的复制缺陷型腺病毒载体。

腺病毒在肿瘤基因治疗中有很好的治疗效果和应用前景，具有诸多优势:①腺病毒不仅能高效感染多种增殖细胞，也能感染静息细胞;②不与细胞的基因组发生整合，不引起基因突变，并可携带较大片段的外源基因;③其感染宿主范围广，对人致病性低;④感染宿主细胞后表达的目的抗原，较质粒载体易获得更强的免疫应答〔12〕。因此，腺病毒成为继逆转录病毒后被广泛应用于基因免疫治疗的一种比较理想的表达载体。我们选用Adxsi系统，该系统由穿梭质粒载体系统，病毒骨架载体，及包装细胞系HEK293构成，其中pAdxsi骨架质粒是携带5型腺病毒基因组(去掉了E1区和E3区)，所以该系统构建的腺病毒载体属于复制缺陷型腺病毒载体。该系统采用直接连接的方案进行穿梭载体与病毒骨架质粒的重组。直接连接的方案采用I-Ceul及I-Scel双酶切位点定向克隆，采用这两个酶切位点的好处是识别序列非常长，在人的基因组内几乎没有任何这两个酶切位点。Adxsi系统的最大优势是病毒包装稳定，病毒滴度高，可以包装有细胞毒性的基因，也可以包装干扰腺病毒生理过程(感染、复制、包装等过程)的基因。本实验中，Adxsi系统通过控制PSMA基因在包装细胞系中表达从而提高了腺病毒包装的成功率，同时也大大提高了腺病毒的滴度。大量扩增后我们用CsCl纯化法，去除有缺陷的病毒颗粒、细胞碎片和少量培养基成分，最大限度的降低这些污染诱导的免疫学反应〔13，14〕，制备出高滴度(2 ×1010pfu/ml)，高产量的携带PSMA基因的重组腺病毒。

为了解携带人PSMA基因的重组腺病毒能否表达，本研究将包装的病毒感染HEK293细胞后，通过荧光倒置显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达。以病毒裂解液为模板进行的PCR反应也证实病毒基因组中含有PSMA的基因片段。同时收集转染后的HEK293细胞，进行Western印迹鉴定，能见大小基本正确的目的蛋白条带。我们成功地制备了表达人类PSMA基因的重组腺病毒，这一初步结果为进一步研究用其制备树突细胞疫苗治疗前列腺癌打下基础。

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