血红素加氧酶-1基因转染对内毒素诱导的ECV304细胞氧化损伤的影响

张培胜 邢邯英 野战鹰 (河北省人民医院老年医学重点实验室，河北 石家庄 05005)

血红素加氧酶(HO)是血红素降解起始酶和限速酶，HO-1为其诱导型。研究表明HO-1及其催化产物一氧化碳、胆红素等均在抗氧化过程中发挥积极作用〔1，2〕。内毒素主要的致毒成分脂多糖(LPS)可以诱发多种炎性介质释放和自由基生成增加，直接造成组织细胞的氧化损伤〔3，4〕。本研究借助逆转录病毒将HO-1基因转染入人脐静脉内皮细胞系ECV304，观察HO-1基因表达上调对内毒素培养的ECV304细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 锌原卟啉(zinc protoporphyrin，Znpp-Ⅸ)，LPS均购自美国Sigma公司。G418、DMEM培养基购自Gibco公司。乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物试剂公司。

1.2 细胞系及其培养 已转染人HO-1(hHO-1)cDNA全长的双噬性逆转录病毒包装细胞系PA317/hHO-1(逆转录病毒载体重组体XM6/hHO-1经Lipofectin介导转染入PA317细胞，同时带有新霉素耐药基因NeoR以用于选择)〔5〕由首都医科大学细胞生物系安威教授惠赠。PA317/hHO-1和小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM中，ECV304细胞培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基(含D-葡萄糖5.5 mmol/L)中。

1.3 人血红素加氧酶-1基因转染ECV304细胞 PA317/hHO-1复苏、传代后收集病毒上清。以NIH3T3为靶细胞测定病毒滴度为4×105CFU/ml。此滴度的病毒上清可以完全胜任离体情况下的基因转染，可以用于下一步实验。2×105个ECV304细胞接种于25 cm2细胞培养瓶，24 h后加入1 ml病毒上清及终浓度为8 μg/ml的polybrene于37℃培养6 h，然后加入3 ml新鲜的培养液继续培养48 h。细胞传代并加入500 μg/ml G418(敏感剂量)，筛选14天后得到抗性克隆，继续扩大培养得到转染细胞，命名为ECV/hHO-1。选取生长良好且较为孤立的克隆，用胰蛋白酶消化后移到新的培养瓶中，扩增备用。ECV304转染细胞经过 G418(500 μg/ml)连续2次筛选，ECV/hHO-1均能在含G418的培养液中生长，而对照细胞则全部死亡。

1.4 转染细胞中血红素加氧酶-1 mRNA和蛋白表达水平的检测 Trizol一步法提取ECV304/hHO-1细胞和ECV304细胞总RNA。逆转录反应总体积为25 μl，包括RNA 10 μg。取逆转录反应液，分别进行hHO-1和内参照β-actin基因的PCR扩增。hHO-1的上、下游引物按照文献〔5〕设计。扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。

提取ECV304/hHO-1细胞和ECV304细胞总蛋白，蛋白定量后进行Western印迹检测。取100 μg蛋白经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。再分别与一抗(HO-1兔多克隆抗体按1∶1 500稀释，GAPDH单抗为1∶2 500稀释)和二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或兔抗鼠I gG抗体按1∶2 000稀释)4℃过夜和室温孵育2 h、DAB显色、照相、图像分析仪分析结果。

1.5 LDH释放率测定 ECV304及ECV/hHO-1细胞以1×105个/ml接种于24孔板。无血清DMEM处理24 h后，细胞分为3组:① 未转染ECV304组;② ECV304/hHO-1组;③Znpp-Ⅸ(20 μmol/L)+ECV304/hHO-1组。每组细胞分别用含或不含LPS(5 mg/L)的培养基培养24 h，收集培养上清液。每孔加入0.5 ml细胞裂解液(1%曲拉通X-100，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA)，振荡 20 min，收集细胞裂解液，用比色法测定每孔(n=6)培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性。以培养上清液中LDH活性单位占培养上清液加细胞裂解液中LDH总活性单位的百分比作为LDH释放率。

1.6 MDA含量测定 细胞分组及处理因素同LDH释放率测定。作用24 h后弃去上清，用PBS洗3次后每孔加入0.5 ml细胞裂解液，待细胞充分裂解后，参照MDA检测试剂盒说明书测定MDA含量。细胞蛋白定量采用考马斯亮蓝法。

1.7 统计学处理 采用SPSS11.0版统计分析软件包处理实验数据。数据采用±s表示，多组计量资料显著性检验用单因素方差分析(ANOVA)和两两比较(LSD法)。

2 结果

2.1 血红素加氧酶-1转基因ECV304细胞的建立 RT PCR分析表明未被转染的ECV304细胞hHO-1 mRNA表达量很低，而转染hHO-1基因的ECV304表达量显著升高(图1)。Western印迹技术检测ECV304细胞HO-1蛋白(32 kD)条带较浅，而转染细胞HO-1蛋白表达显著增强，与ECV304细胞相比升高1.7倍，其IOD比值有显著差异(图2)。每种细胞GAPDH蛋白(36 kD)条带表达水平相同，提示上样量无差异。

2.2 LDH释放率和细胞MDA含量 三组细胞在DMEM培养基中培养24 h后，LDH释放率和细胞MDA含量相比均无统计学差异。在加用LPS(5 mg/L)培养24 h后，ECV304细胞LDH释放率和MDA含量明显增加 (P＜0.05);ECV304/hHO-1细胞组较ECV304细胞有所降低，两者相比有显著差异(P＜0.05)。在相同培养条件下加用Znpp-Ⅸ，ECV304/hHO-1细胞LDH释放率和细胞MDA含量进一步上升 (P＜0.05)。见表1。

图1 ECV304细胞和ECV304/hHO-1细胞HO-1 mRNA RT-PCR扩增图片

图2 ECV304细胞和ECV304/hHO-1细胞HO-1蛋白Western印迹分析

表1 各组细胞LDH释放率和MDA含量的变化(± s，n=6)

表1 各组细胞LDH释放率和MDA含量的变化(± s，n=6)

与同组内DMEM培养基比较:1)P＜0.05;与相同处理因素的ECV304组比较:2)P＜0.05;与相同处理因素的ECV304/hHO-1组比较:3)P＜0.05

组别 MDA含量(nmol/mg蛋白)DMEM培养基 DMEM培养基+LPS(5 mg/L)LDH释放率(%)DMEM培养基 DMEM培养基+LPS(5 mg/L)ECV304组 0.62±0.11 1.54±0.071) 17.64±4.22 37.99±5.281)ECV304/hHO-1组 0.63±0.09 1.12±0.292) 15.82±4.81 22.10±3.772)ECV304/hHO-1+ZnPP-Ⅸ 组 0.64±0.12 1.95±0.223) 18.37±5.33 48.31±4.483)

3 讨论

HO是参与血红素降解的重要酶类之一，在微粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素P450还原酶协同参与下形成一个短暂的电子传递链，其主要功能是分解血红素的四吡咯环结构从而生成等摩尔的游离铁、一氧化碳和胆绿素，而胆绿素在胆绿素还原酶的催化下迅速转化为胆红素。HO-1属诱导型，正常情况下在大多数组织中表达量很低(只在脾、肝脏和睾丸中有较高表达)，但多种应激性因素可以诱导HO-1的表达和活性增强，如内毒素、高(低)氧、紫外线、重金属和血红素等〔6～8〕。大量研究证实上调HO-1的表达可以保护组织细胞、对抗氧化应激损伤。据此我们推测如果能够人为地增加HO-1的表达水平将有助于提高ECV304细胞抗氧化损伤能力，发挥保护作用。本实验中与LPS共培养的ECV304细胞MDA含量和LDH释放率均增加，两者变化相一致。LDH是能量代谢中的一种重要酶类，广泛存在于各类组织细胞，其释放率可用来衡量细胞受损程度，而MDA是氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化所形成的产物，其含量可以反映组织氧化损伤程度，这一结果提示氧化损伤在LPS致细胞损伤过程中发挥重要作用。ECV304细胞在转染HO-1后，可以有效地降低氧化应激水平，而应用Znpp-Ⅸ可抑制HO-1活性，加重细胞的损伤。

逆转录病毒载体介导的基因转染是基因治疗的方法之一，虽然病毒滴度低于腺病毒载体，但对人体相对安全，不会造成全身性病毒感染的后果;而且能稳定地整合到宿主基因组，并将目的DNA传递给整个细胞群体，不会随着细胞的分裂而丢失。本实验借助逆转录病毒载体将外源性HO-1基因导入ECV304细胞，结果表明目的基因在转染细胞表达量增高，而且传代后维持高表达水平。应用逆转录病毒载体尤其是双嗜性病毒时，生物学安全问题是不容忽视的。逆转录病毒虽能将目的基因有效的整合入宿主细胞基因组中，形成稳定的转化细胞，但是这种整合是随机的，目的基因表达的稳定性与插入的位点、方向及周围基因等多种因素有关，同时基因的插入对目的细胞的其他生物学行为的影响也缺乏更多的证据。本实验仅限于细胞水平上一个初步的、探索性的基因治疗试验，在整体情况下细胞可处于不同的分裂期，由于逆转录病毒只能感染分裂期细胞，而且易被体内补体所灭活，转染效率很低。如何确保逆转录病毒使用的安全性和增强在体转染的效率将会是今后工作的重点。

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