D-半乳糖致衰老模型大鼠脑组织Ach活性、NGF表达变化及山茱萸多糖的干预作用

周少丞 韩晓明 王力冬 康 琦 燕 闹 于永春 欧 芹

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

许多学者已将脑内乙酰胆碱 (Ach)的含量、胆碱乙酰转移酶 (ChAT)活性和胆碱酯酶 (AchE)活性作为人类脑功能衰老研究的主要指标，也作为探讨阿茨海默病 (AD)药物治疗机制的重要方面〔1，2〕。目前研究表明，Ach代谢失调所致生化改变是中枢神经系统衰老的重要因素之一〔3，4〕。山茱萸多糖是山茱萸的主要成分，具有提高衰老小鼠抗氧化能力、降低一氧化氮 (NO)及其合酶 (NOS)及白细胞介素-6(IL-6)水平，提高IL-1、IL-2水平的作用〔5，6〕;体外实验证实其还能显著降低衰老人胚肺二倍成纤维 (HDF)细胞β-半乳糖苷酶、P16、细胞周期蛋白因子-1(cyclinD1)的表达，提高热休克蛋白70(HSP70)、周期素依赖性激酶4(CDK4)表达水平，减轻细胞DNA损伤〔7，8〕。本实验旨在探讨D-半乳糖衰老模型大鼠神经生长因子 (NGF)和AchE活性的变化，以及山茱萸多糖对抗脑衰老作用的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 山茱萸购自佳木斯宝泰医药大药房，由本校生药教研室鉴定。脑脂褐素(LP)和AchE测试盒为南京建成生物公司产品，RT-PCR试剂盒为大连宝生物有限公司提供，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。山茱萸多糖的制备参照李平等〔9〕方法，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并制成0.05 g/ml的水溶液备用。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 纯系Wistar大鼠46只，雌雄各半，2～3月龄，体重(225±25)g，由佳木斯大学动物实验中心提供。随机分为3组，青年对照组(QN，12只)、衰老模型组(SL，12只)、山茱萸多糖给药组24只，其中给药组分为小剂量组(FCPS，12只)和大剂量组(FCPL，12只)，大鼠适应2 w后开始实验。QN每日上午侧腹部皮下注射生理盐水，剂量参照其他给药组 D-半乳糖给药量，SL和给药组按48 mg·kg－1·d－1皮下注射D-半乳糖42 d后，SL经胃给予相当于给药组药量体积的温开水，FCPS和FCPL分别按照0.14 g/kg体重、0.28 g/kg体重经胃给药，连续给药30 d。于末次给药后次日处死大鼠，4℃取脑皮质，分两份分别用于制备10%组织匀浆和液氮中保存备用。

1.2.2 指标检测 LP采用荧光分光光度法，考马斯亮蓝法测蛋白质含量，LP以μg/g组织表示。AchE活性采用分光光度法，以U/mg蛋白表示。Trizol常规提取总RNA，琼脂糖电泳法检测RNA完整性，Beckman DU-800紫外检测RNA含量。RTPCR法检测NGF mRNA表达，以β-肌动蛋白(β-actin)作内参，反转录条件:52℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，1 个循环;然后行 PCR。NGF上游引物:5'-GATCGGCGTACAGGCAGAAC-3'，下游引物:5'-GGCTCGGCACTTGGTCTCAA-3'，扩增片段长度504 bp;β-actin引物:上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物:5'-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，扩增片段长度207 bp。PCR反应体系:5×PCR 缓冲液 10 μl，灭菌蒸馏水32.75 μl，Taq 酶 0.25 μl，上游引物和下游引物各 1 μl，反转录产物 5 μl;PCR 条件:94℃ 2 min ，1个循环;94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 1 min，29个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶80 V电泳1.2 h，溴乙锭(EB)染色，采用凝胶成像系统分析，以ODNGF/ODβ-actin表示NGF mRNA表达水平。

1.3 统计学分析 应用SPSS11.0统计软件，实验数据以±s表示，数据统计采用方差分析，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 山茱萸多糖对衰老模型大鼠脑LP含量和AchE活性的影响 SL和给药组大鼠LP含量均明显高于QN(P＜0.01);两给药组LP均较SL大鼠明显降低(P＜0.05，P＜0.01);其中FCPL与FCPS有显著差异(P＜0.05)。SL大鼠AchE活性显著升高(P＜0.01);两给药组AchE明显低于SL大鼠(P＜0.05，P＜0.01)，其中FCPL降低更显著(P＜0.01);SL、FCPS和FCPL大鼠AchE活性明显高于QN大鼠(P＜0.01，P＜0.05)，差异有统计学意义。见表1。

2.2 D-半乳糖对大鼠脑NGF表达的影响及山茱萸多糖的作用 SL和FCPL、FCPS大鼠脑皮层NGF mRNA表达(0.426±0.056，0.537±0.047，0.615±0.051)均明显低于 QN(0.728 ±0.071)(P ＜0.01，P ＜0.05);而 FCPL、FCPS则明显高于 SL(P＜0.01，P＜0.05)，其中以 FCPL组表达降低较显著(P＜0.05)。见图1。

表1 山茱萸多糖对衰老模型大鼠LP含量和AchE活性的影响(±s)

表1 山茱萸多糖对衰老模型大鼠LP含量和AchE活性的影响(±s)

与青年组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与衰老模型组比较:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;与小剂量组比较:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01

组别 n LP(μg/g组织) AchE(U/mgpro)青年对照组(QN)12 1.329±0.128 0.463 ±0.056衰老模型组(SL) 10 2.505±0.3142) 0.752±0.0472)小剂量组(FCPS) 12 1.951±0.1752)4) 0.687±0.0632)3)大剂量组(FCPL) 12 1.653±0.1761)4)5) 0.532±0.0462)4)6)

图1 各组大鼠脑NGF mRNA表达

3 讨论

本研究结果说明衰老模型大鼠脑组织NGF mRNA水平较青年对照组降低，而AchE活性和LP水平增高，说明D-半乳糖可能通过诱导大鼠细胞代谢障碍或DNA损伤，导致自由基代谢紊乱，LP积累过多，后者可通过破坏磷脂膜结构，导致线粒体和粗面内质网减少以及空泡形成等亚细胞结构的变化，并使神经元数目减少。而神经元数量的减少进一步导致学习记忆功能的减退〔10〕。同时AchE活性的升高必然导致Ach降解加速，引起脑功能的减退。也有研究者发现，脑功能的减退与NGF受体脱失，胆碱能神经元对NGF摄入量减少有关。由靶区(海马及新皮质)产生的NGF可经逆行运输到中枢神经系统基底前脑胆碱能神经元胞体，发挥其靶源性营养作用。有研究提出胆碱能神经元亚群在学习和记忆中具有特殊功能〔3〕。而山茱萸多糖能抑制脑内LP的积累，从而使脑组织损伤终止并逐渐修复，提高老龄小鼠学习记忆功能。山茱萸多糖还通过上调NGF表达增加内源性NGF的含量，促进神经支配区的胆碱能纤维数量增加和单个轴突末梢形成较多的突触，有助于神经元损伤后功能的迅速恢复。此外，山茱萸多糖还抑制AchE的活性，可通过减少Ach的分解、增加其合成和释放这一过程而实现。

综上所述，山茱萸多糖可抑制衰老模型大鼠脑脂质过氧化，上调NGF基因表达，提高AchE活性，进而改善衰老模型大鼠的脑功能，且山茱萸多糖大剂量的效果好于小剂量。

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