复元胶囊对气虚血瘀证模型大鼠血栓前状态的影响

徐 丹 李荣亨 李学荣 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科,重庆 400016)

气虚血瘀证是诸多老年病的常见证候,尤其在心、脑血管疾病中更为常见,中医学认为 “气为血之帅,气能行血”,若气虚鼓动无力,循经之血缓慢滞涩瘀积于经脉中形成血瘀。目前普遍认为中药益气、活血方制剂能有效改善老年病中气虚血瘀证症状。复元胶囊在益气、活血中药的基础上加用补肾中药,前期研究表明〔1,2〕,复元胶囊具有调节血管平滑肌细胞 (VSMC)收缩与舒张平衡及调节VSMC分泌多种血管活性物质的作用。本文采用多因素复合方法制作大鼠气虚血瘀证模型,检测大鼠血浆血管性血友病因子 (vWF)、组织型纤溶酶原激活物 (t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物 (PAI)的含量,探讨益气活血补肾复方复元胶囊对气虚血瘀证大鼠血栓前状态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 体重500～600 g的16月龄的SD大鼠60只,雌雄各半,由重庆医科大学动物中心提供,合格证号:SCXK(渝)2010-0001。

1.1.2 实验药物 复元胶囊由生晒参、黄芪、丹参、鹿茸、淫羊藿、川芎、枸杞等组成,具有益气活血补肾的功效,重庆希尔安药厂生产。每粒胶囊重0.41 g,相当于生药3 g。芪参胶囊由黄芪、丹参、人参、三七、水蛭等组成,具有益气活血的功效,河南省新谊药业股份有限公司生产,批号:Z20064445,每粒胶囊重750 mg。

1.1.3 主要仪器 全自动血液流变测定仪(重庆医科大学附一院中西医结合科提供)、移液枪、离心机、水浴箱、冰箱、试管、酒精灯、真空抗凝采血管、酶标仪都由重庆医科大学眼科实验室提供。

1.1.4 主要试剂 双蒸水由实验室提供,大鼠组织型纤溶酶原激活物(TPA)ELISA试剂盒、大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA试剂盒、大鼠血管性血友病因子/瑞斯托霉素辅因子(vWF)ELISA试剂盒,由上海源叶生物科技有限公司提供,批号:20101227。

1.2 方法

1.2.1 造模 60只SD大鼠在实验室喂养1 w,适应环境。1 w后随机抽取10只大鼠为空白组,余下50只大鼠每日摄正常食量的2/3,并加入高脂饲料(每5 kg普通饲料加猪油1 kg),在每日控制食量的基础上将大鼠放入凉水(10～14℃)中游泳,直至疲劳,将其打捞出水面,捞出后不予保温及擦拭水迹,使之暴露于空气中自然晾干。每日一次,连续4 w,建立气虚血瘀证模型〔3,4〕,即出现精神萎靡,倦怠嗜睡,攻击性减退,毛发枯黄无润泽,轻度稀便,尾尖出现轻度瘀斑血点。随机取10只模型大鼠和空白组10只大鼠,抽尾静脉,测定血液流变学,表明造模成功。见表1。

表1 造模组与空白组血液流变学的变化(±s,n=10)

表1 造模组与空白组血液流变学的变化(±s,n=10)

与空白对照组比较:1)P＜0.05

组别 高切(mps)200/s中切(mps)30/s低切(mps)3/s红细胞聚集指数(Arbc)电泳时间(s)空白组4.81±0.22 6.00±0.28 9.23±0.56 7.94 ±0.57 17.51±1.17模型组 9.03 ±0.091)11.64 ±0.531)16.61 ±0.29 1)11.09 ±0.381)29.99 ±0.191)

1.2.2 分组 造模成功后将50只SD大鼠随机分为模型组,芪参胶囊组,复元低剂量组,复元中剂量组,复元高剂量组。

1.2.3 给药 造模成功后根据 Meeh-Rubner氏公式〔5〕计算给药剂量,计算出大鼠每日应服复元胶囊(447.49 mg·kg-1·d-1),芪参胶囊(515.7 mg·kg-1·d-1)。按照复元胶囊大、中、小剂量组以 4∶2∶1的给药标准,灌胃,给药容量为13.3 ml/kg,模型组和空白组给予等量生理盐水,每天1次,连续4 w。芪参胶囊组的给药剂量为520 mg/kg,每天一次,连续给药4 w。动物分组及给药方法,见表2。

表2 动物分组以及饲养方法

1.2.4 观察指标

1.2.4.1 一般情况 观察大鼠的精神状况,对抗及攻击力,毛发,大便,尾部瘀斑轻重,游泳及耐疲劳时间。

1.2.4.2 血液黏度测定 用真空抗凝管取下腔静脉血3 ml,采用全自动血液流变测定仪,检测全血黏度、红细胞聚集指数、红细胞电泳时间。

1.2.4.3 vWF、PAI-1和t-PA测定 给药4 w后取标本:将大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧固定于手术台上,于胸骨柄上一横指、正中线向右旁开1 cm处做切口,于触及动脉搏动处分离肌肉可见右侧颈动脉,以5号头皮针穿刺血管取血,放于含有1/10容积的0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝试管中,经3 000 r/min离心10 min后,收集上清液(血浆,黄色),放置于-20℃低温冰箱中保存测定。采用酶联免疫吸附法测定 vWF,采用ELISA测定PAI-1和 t-PA,均严格按照试剂说明书进行操作,根据所绘标准曲线计算各待测标本含量。

1.3 统计学分析 统计学分析采用SPSS.17.0统计学分析软件进行处理,计量资料结果全部采用±s表示,多组均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和两两比较(LSD法)。

2 结 果

2.1 一般情况 模型组与空白组比较,精神萎靡,对抗性,攻击性差,毛发枯黄无光泽,大便稀溏,耐疲劳时间延长,尾尖部出现不同程度的瘀血点。芪参胶囊组与模型组比较,精神有所改善,对抗性攻击性较好,毛发枯黄稍有光泽,大便稍稀溏,尾部瘀血点改善不明显。复元胶囊各组与模型组比较,精神好,对抗性攻击性强,毛发润泽,大便成形,耐疲劳时间与空白组相当,尾部瘀斑明显减退。

2.2 WF、PAI-1和t-PA含量 模型组与空白组比较,vWF、PAI-1含量明显升高,t-PA明显下降(P＜0.05)。复元胶囊各组、芪参胶囊组与模型组比较,vWF、PAI-1含量明显下降,t-PA明显升高(P＜0.05),其中复元胶囊中剂量组作用效果最为明显,且复元胶囊各组vWF、PAI-1含量低于芪参胶囊组(P＜0.05),而复元胶囊各组 t-PA高于芪参胶囊组(P＜0.05)。见 表3。

表3 各组大鼠t-PA、PAI、vWF比较(±s)

表3 各组大鼠t-PA、PAI、vWF比较(±s)

与模型组比较:1)P＜0.01;与芪参胶囊组比较:2)P＜0.01

组别 n t-PA(IU/ml) PAI(IU/ml) vWF(IU/ml)空白组 10 0.998 ±0.0761) 0.346±0.0361) 0.346±0.0361)模型组 9 0.277±0.054 0.974±0.032 0.974±0.032芪参胶囊组 9 0.465±0.0511) 0.762±0.0251) 0.762±0.0251)复元胶囊低剂量组 10 0.668±0.0631)2) 0.612±0.038 1)2) 0.612±0.0381)2)复元胶囊中剂量组 9 0.971±0.0381)2) 0.347±0.031 1)2) 0.347±0.0311)2)复元胶囊高剂量组 9 0.681±0.0631)2) 0.632±0.017 1)2) 0.632±0.2251)2)

3 讨 论

本实验采用饥饿、劳累、高脂等多因素复合作用来建立气虚血瘀证模型。根据中医气血关系理论,气为血帅,气能推动血液运行,气虚则气不行血,气不摄血,导致血瘀;根据中医病因病机方面考虑,气虚血瘀证病机是气虚为本在先,血瘀为标产生于后,故造模重点应放在血瘀之根本原因-气虚的致病因素上。本实验采用上述多因素复合方法成功制作了气虚血瘀证模型,大鼠出现了不同程度的气虚、血瘀相关症状表现,体重减轻,血液流变学异常,复合大鼠气虚血瘀证模型。

血栓前状态是指各种原因引起的血管内皮细胞、血小板功能、纤溶系统等有关因子发生变化或血黏滞度增加所引起的病理状态,有利于血栓形成的病理过程。

vWF是血管内皮细胞特异性标志物之一〔6〕,vWF在微血管内皮细胞受到刺激时释放至血浆,其水平升高可作为微血管内皮细胞受损的标志〔7〕,vWF与微血管病变的关系密切。t-PA的血液含量及活性能直接反映纤溶系统功能,可预测血栓形成的危险度〔8〕。体内同时存在着纤溶酶原激活物抑制物(PAI),通过与t-PA形成1∶1分子复合物,使t-PA失活〔9〕。t-PA与PAI是维持凝血与纤溶动态平衡的一对重要因子,两者失衡则易导致出血或凝血。气虚血瘀证多见于心脑血管疾病,慢性肾病,肿瘤等,上述疾病都较易容易形成血栓。

本实验研究结果说明气虚血瘀证大鼠不仅存在内皮细胞的结构或功能的异常,同时还处在一个血栓前状态。祖国医学认为,气有推动,固摄,温煦血液的功能,气虚则上述功能减弱,导致血液停滞而瘀。肾为先天之本,肾气衰则元气亦衰。因此补肾气是治疗气虚病证的根本。芪参胶囊(黄芪、丹参、人参、三七、水蛭等)是由益气活血中药组成的,复元胶囊在益气活血中药的基础上加用补肾药,如鹿茸、淫羊藿、肉苁蓉等,具有益气活血补肾之功效。实验证实三七皂苷、水蛭素、黄芪、人参皂苷有调节凝血与纤溶的作用,改善 t-PA 与 PAI的失衡〔10～13〕。本实验可见加有补肾中药的复元胶囊能更有效的改善血栓前状态,且没有药物剂量依赖性。

本研究表明了运用益气活血法补肾比单用益气活血法更能有效的调节气虚血瘀证大鼠的血栓前状态,维持t-PA/PAI之间的平衡,其作用机制可能与降低vWF因子含量,改善内皮细胞功能或结构有关。复元胶囊中补肾药物的药理研究中,没有报道有直接影响凝血、纤溶因子的作用,更确切的机制有待更进一步的研究。

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