MPN患者 JAK2基因 V617F点突变的检测及意义

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(1南京中医药大学,南京 210029;2南京中医药大学第一附属医院)

Janus激酶(JAK)是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶。JAK2是 JAK家族中受到高度关注的一员,其广泛分布于体细胞的胞质中,参与造血和免疫等系统的信号转导。多项研究[1～5]证实,真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(PMF)等疾病中存在 JAK2激酶 V 617F点突变。该突变位点在 DNA序列的第 1 849位碱基,由胸腺嘧啶代替了原有的鸟嘌呤(G→T),导致编码蛋白第 617位的苯丙氨酸被缬氨酸代替,引起该基因编码的酪氨酸激酶活性增高。研究证实[6],JAK2 V617F是发生于干细胞水平的突变,是 PV、ET等骨髓增殖性肿瘤(MPN)的主要分子致病机制和诊断标志。 2007年 11月～2010年 11月,本研究分析了 JAK2基因 V617F点突变在 MPN患者中的发生情况,探讨其在 MPN诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 临床血液病送检样本 100例,男59例,女 41例,年龄 11～83岁。其中 PV(PV?)20例,有红细胞增多但尚未明确诊断为 PV者 10例,ET(ET?)14例,有血小板增多但尚未明确诊断为ET者 13例,原发性骨髓纤维化(PMF)9例,慢性髓性白血病(CML)2例,其他 MPN 6例,其他不明原因白细胞升高患者 8例;另有急性白血病(AML)1例,骨髓增生异常综合征(MDS)10例,腔隙性梗死3例,慢性肾炎 1例,大 B细胞性淋巴瘤 1例,异体胎肝移植患者 1例,正常体检者 1例。样本中 91例为抗凝血,8例为石蜡包埋骨穿组织学检测样本,1例为骨穿送检骨髓液。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用 OMEGA bio-tek血液 DNA提取试剂盒及组织 DNA提取试剂盒,按照说明书操作。用 eppendorf核酸定量仪选择 dsDNA为测定目标测定 DNA浓度,要求样本 260 nm吸光率大于0.05,DNA浓度大于 2.0μg/μl。

1.2.2 PCR扩增 ①PCR引物:检索 NCBIJAK2基因序列设计的第 12,14外显子特异性引物两对,由上海生工公司合成。②PCR反应体系:总体系 20 μl,PCR缓冲液,HotStarTaq DNA聚合酶 0.5 U,1×Q体系溶液,dNTP混合液 200μM,引物各 200 nM,模板 DNA 200～300 ng,双蒸水 8.8μl。③PCR反应条件:95℃预变性 15 min,94℃变性 50 s,63℃～58℃退火 1min,72℃延伸 1 min,共循环 10次,94℃变性 50 s,57℃退火 1 m in,72℃延伸 1 min,共循环 30次,最后于 72℃延伸 10 min。每批次设置相应对照和复管进行质控。

1.2.3 PCR产物纯化与测序 用 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察 PCR扩增产物是否为单一目的条带。用 PCR清洁试剂盒对 PCR产物进行过柱纯化,去除 dNTP、游离引物等。取适量 PCR纯化产物,加ddH2O至 10 μl。使用 Bigdye Terminator v3.1 kit反应体系进行测序。测序 PCR热循环条件:96℃,10 s→(96℃ 10 s→50℃ 5 s→60℃ 4 min)×25个循环→60℃4min,4℃保温。

1.2.4 测序产物纯化与分析 采用酒精/EDTA/NaAc法[7]。溶解后的样品于 95℃变性 4min,迅速置冰中冷却 4 min后,上样于 ABI-3100基因分析仪上进行电泳。用测序分析软件 SeqScapeV2.1.1进行结果分析。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件。组间比较行 χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

经直接测序法测定,100例样本中,有 52例检测了第 12,14两个外显子,48例仅检测第 14外显子。未发现第 12外显子突变。V617F点突变情况见表 1。由表1可见,PV、ET、PMF、CML、其他 MPN、其他不明原因白细胞升高患者中均检测到 V 617F点突变,非 MPN样本中均未发现 JAK2 V617F位点的突变,两组相比,P＜0.01。此外,ET患者中检出第 14内含子 C/T突变 1例。

表1 100例样本中 V 617F位点的突变情况(例)

3 讨论

MPN是一类克隆性造血干细胞疾病,以骨髓中一系或一系以上髓系(如粒系,红系,巨核系和肥大细胞系)增殖为特征。常伴有外周血粒系、红系、巨核系和(或)肥大细胞系细胞数量不同程度增多,不伴有成熟分化障碍。其临床表现具有异质性,晚期则出现骨髓纤维化或转为急性白血病。近年来多项研究[3,6～8]指出,JAK2 V617F位点突变可作为 MPN诊断中的重要分子遗传学参考指标,该突变是BCR/ABL阴性 MPN的主要分子致病机制和诊断标志。该突变发生于造血干/祖细胞阶段,携带突变的造血干/祖细胞获得生存优势而进一步分化发育。一般临床上利用外周血检测该突变[3,6]。

本研究采用外周血有核细胞提取基因组 DNA,或直接用骨髓活检样本,使用直接测序法,对 100例样本中 JAK2基因的第 12、14外显子突变热点区进行了检测。其中 JAK2基因第 12外显子未检测到突变,V617F及其他类型的突变总检出率为 38.0%(38/100)。 PV、ET、PMF、CML、其他 MPN、其他不明原因白细胞升高患者中均检测到 V617F点突变。且 PV患者中突变阳性率为 86.3%,ET患者中突变阳性率为 50%。而其他 AML、MDS及腔隙性梗死、慢性肾炎、大 B细胞性淋巴瘤、异体胎肝移植患者、正常体检者等非 MPN患者中均未检出 V617F的突变。这与国外研究[2,3,6]结果基本一致。再次证明JAK 2基因突变在 MPN的发生率与其他血液恶性疾病相比有显著性差异,JAK2 V617F位点突变可以作为诊断 MPN的一项重要指标。

此外,本研究中采用的直接测序法准确率及重复性可以满足临床检测的要求,对突变率的检出也达到了较高水平,且具有稳定、直观及灵活的特点,可以满足临床 MPN基因检测的需要。进一步研究 JAK2基因 V617F点突变在 MPN发病中的作用,将有助于特定靶向药物的研究[9],是 MPN治疗的新方向。

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