艾灸对慢性疲劳大鼠免疫功能的影响

曾 进，黄 瑾，吕明庄

(1.深圳龙珠医院，广东 深圳518005;2.江西青峰药业有限公司学术部，广东 深圳518034;3.澳门科技大学医院，澳门)

1 材料和方法

1.1 实验动物

青年健康SD雄性大鼠36只，3～4月龄，体重(200±20)g，由贵阳医学院实验动物中心提供［合格证批号为SCXK－(黔)2002－0001］。

1.2 药物及主要试剂

刀豆蛋白A(ConA)和四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品;IL－2和TNF－α放免试剂盒(天津九鼎医学生物工程有限公司);兔抗大鼠IL－2和兔抗大鼠TNF－α试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);PV－6001兔二步法检测试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 仪器

550 型酶联免疫检测仪(伯乐太平洋有限公司);二氧化碳培养箱(日本)。

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组

SD雄性大鼠36只，随机分为正常对照组、CFS模型组、艾灸组，每组12只。

1.4.2 造模方法

适应性喂养7天，采用悬吊冷水游泳复合应激因素复制慢性疲劳动物模型，连续12天［1］。

1.4.3 治疗方法

正常组:不做任何治疗，每天空抓1次，共12天。模型组:不做任何治疗，每天空抓1次，共12天。艾灸组:艾灸穴位肝俞、脾俞、肾俞［2］，隔日1次，每次用艾柱每穴灸1 cm。左右同时灸，灸6次，共12天。

1.4.4 标本采集

治疗结束后，模型组死亡2只，感染2只，死亡原因为游泳溺水。艾灸组感染2只。剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉(100 g/0.3 ml)，剪开腹股沟动脉，离心塑料管取血2 ml，台式高速离心机上3 000 r/min离心10 min。吸取血清置于－30℃冰箱保存待测。

1.4.5 指标检测

免疫器官指数:将处死后的各组大鼠分别取出胸腺、脾，去除脂肪、筋膜后称重，计算胸腺指数和脾指数，单位mg/g体重。

脾淋巴细胞的增殖转化能力:采用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖情况。无菌取脾，常规制成淋巴细胞悬液，调细胞浓度为1.5×106/ml，加入96孔板中，再加入刀豆蛋白A(终浓度为5 μg/ml)，置于CO2培养箱中60 h，培养结束前4 h加入MTT，培养结束后加入二甲基亚枫，于酶标仪570 nm处比色测定吸光度值。

IL－2和TNF－α:采用放射免疫检测法(RIA)，按天津九鼎医学生物工程有限公司的放免药盒说明书操作。

HE染色观察大鼠脾脏一般形态学变化:将分离取出称重后脾脏放于10%中性福尔马林固定24 h，梯度脱水，二甲苯透明、石蜡包埋，切片(3～5 um)，HE病理染色观察脾脏一般形态学变化。

免疫组化测定:采用PV免疫组化染色法，按北京中杉金桥生物技术有限公司药盒说明书操作。

1.4.6 图像分析及统计学处理

用Biomias99图象分析系统对平均光密度进行图像分析。数据采用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，各组间比较采用单因素方差分析(One－way ANOVE)和q检验。

2 结果

2.1 免疫器官指数 见表1。

表1 各组大鼠胸腺指数和脾指数比较(±s)

表1 各组大鼠胸腺指数和脾指数比较(±s)

注:与正常组比较，ΔP＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05。

2.2 脾淋巴细胞增殖转化力 见表2。

表2 各组大鼠脾淋巴细胞增殖转化力比较(±s)

表2 各组大鼠脾淋巴细胞增殖转化力比较(±s)

注:与正常组比较，ΔP＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05。

2.3 血清白介素－2(IL－2)和肿瘤坏死因子 －α(TNF－α)浓度值 见表3。

表3 各组大鼠治疗后血清IL－2和TNF－α浓度值比较(±s)

表3 各组大鼠治疗后血清IL－2和TNF－α浓度值比较(±s)

注:与正常组比较，ΔP＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01;*P＜0.05。

2.4 HE染色结果

HE染色正常组见图片1。模型组大鼠脾脏红髓缩小，白髓萎缩，脾组织内脾小梁排列紊乱，中央动脉玻变。见图2a～2b。治疗组均有不同程度改善，见图3。

图1 正常组大鼠脾脏组织

图2 a模型组大鼠脾脏组织

图2 b模型组大鼠脾脏组织

2.5 免疫组化染色结果 见表4。

表4 各组大鼠IL－2和TNF－α表达的平均光密度比较(±s)

表4 各组大鼠IL－2和TNF－α表达的平均光密度比较(±s)

注:与正常组比较，ΔP＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01。

图3 艾灸组大鼠脾脏组织

3 讨论

3.1 现代医学对CFS的认识

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是现代医学新认识的一种疾病，由美国疾病控制和预防中心(CDC)于1988年正式命名。这是一种以疲劳为主，伴低热(或自觉发热)、咽喉痛、肌痛、关节痛、头痛、注意力不易集中、记忆力差、睡眠障碍和抑郁等非特异性表现为主的综合征［3］。其原因尚不确定，主要有两种学说:生物感染和由感染直接介导的免疫功能失调［4］。

3.2 免疫与CFS的关系

很多研究表明［5～6］，CFS患者存在免疫功能的异常，主要表现为细胞免疫功能低下。此外，还存在淋巴细胞增殖功能及T细胞亚群数目与比值的改变等［7］。因此，有人也将CFS称为“慢性疲劳免疫功能障碍综合征”。

3.2.1 胸腺指数和脾脏指数与CFS

脾脏及胸腺是淋巴细胞的生发中心，有脾细胞分泌的转移因子(TF)及胸腺分泌的胸腺素，在免疫疾病防治中具有重要的实用价值，因此研究针灸等对免疫器官重量的影响，可推测其对免疫功能的正向调节作用。

3.2.2 脾淋巴细胞增殖转化能力与CFS

T淋巴细胞主要介导细胞免疫，可以调节机体的免疫功能。一般认为，机体的细胞免疫功能差，淋巴细胞转化率低;反之，细胞免疫功能良好，淋巴细胞转化率也较高。因此，根据淋巴细胞转化率(增殖指数)的高低，可判断机体的细胞免疫功能状态［8］。

3.2.3 IL－2和TNF－α与CFS

IL－2与CFS:IL－2主要由活化的CD+4T细胞及少量CD+8T细胞产生，是一种免疫调节淋巴因子。其主要生物学功能是增强NK细胞和CD8+T细胞的活性，刺激此两种细胞产生γ干扰素(γ－INF)，并能诱导IL－1β受体的生成。它有维持T细胞在体外的生长、激活多种免疫细胞、诱导生成等作用，而且T细胞产生的IL－2可进一步刺激其自身受体的表达和分泌，其水平反映了T细胞的功能状态，IL－2的产生能力可作为机体细胞免疫功能的重要指标。

TNF－α与CFS:TNF－α是由被激活的巨噬细胞和单核细胞产生的多肤类介质，在体内具有广泛的生物学作用，可诱导IL－1、IL－6、血小板活化因子(PAF)等细胞因子参与机体免疫调节作用。参与了多种疾病的病理过程，在免疫调节、炎症以及某些慢性病等细胞反应中TNF具有重要作用。有学者［9～10］对CFS患者与正常对照组进行了回顾性的对照研究，发现CFS患者与对照组比较TNF呈显著性升高。

3.3 中医学对CFS的认识

疲劳在《黄帝内经》中多称为“倦”、“懈惰”、“困薄”、“身重”、“体重”、“四肢不举”等。《素问·五藏生成论》云:“肝受血而能视，足受血而能步，掌受血而能摄”，指出肝藏血主疏泄的正常功能是人体活动能力的重要保证。脾主肌肉四肢，“脾病者身重”，“脾气虚则四肢不用”。《黄帝内经》论述“肾足少阴之脉”，“是主肾所生病”，有“嗜卧”之症。“各脉者肾也……太过则令人懈惰”。文献中疲劳涉及的脏腑主要为肝脾肾三脏，与情志、劳逸、气血、肝、脾、肾功能失调有关。

3.4 艾灸治疗CFS的机理分析

艾灸的防病、治病与保健养生作用在古医籍中早有记载。如《本草纲目》曰:“艾，外用灸百病，壮元阳，通经脉，行气补血。”宋·窦材在《扁鹊心书·住世之法》中就有“保命之法，灼艾第一”之说。艾灸对非特异性免疫和特异性免疫功能都有一定的调节作用。在治疗与免疫相关疾病过程中，艾灸具有抗感染、抗自身免疫病、抗过敏反应、抗癌和延缓衰老等作用，这主要是通过调节体内失衡的免疫功能实现的［11］。艾灸对机体的免疫调节作用也是双重的，既能使紊乱的免疫功能向正常状态调整，也能使正常机体的抗病能力增强，这种调节不仅体现在细胞水平，而且体现在分子水平。艾灸治疗慢性疲劳大鼠未见相关文献报道，本实验结果表明:艾灸能使慢性疲劳大鼠脾脏指数提高、脾淋巴细胞增殖转化能力增强、血清IL－2和TNF－α小剂量增加，从而提高了免疫功能，这也可能是艾灸治疗慢性疲劳综合征的机制之一。当然，艾灸对机体的免疫调节还表现在更多方面和更深层次，有待今后作进一步的研究。

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