褪黑素对大鼠急性酒精性肝损伤的作用

洪汝涛，陈世林，阮海玲，梅 俏，许建明

(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化病重点实验室，安徽合肥 230022)

褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的激素之一，体内许多组织器官和肿瘤组织［1］都有MT受体分布，MT以受体依赖或非依赖的方式发挥广泛的生物学作用。近年来发现褪黑素是一种高效的自由基清除剂，其对急慢性肝损伤的保护作用国内外已有研究和报道［2－5］。但MT对急性酒精性肝病的防治未见报道。本研究以急性酒精性肝损伤大鼠为模型，观察MT对急性酒精性肝损伤的作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD♂大鼠24只，购自安徽省实验动物中心，体质量(200±20)g，标准环境适应性饲养1周，给予正常饮食。

1.2 主要药物、试剂 褪黑素系美国Sigma公司产品，临用前以无水乙醇溶解，再加生理盐水稀释至所需浓度(无水乙醇含量≤1%)。乙醇(分析纯)购自上海中试化工总公司，使用前用蒸馏水配成60%的体积分数。MDA、SOD检测试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗试剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗鼠IL-1β多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，内源性生物素阻断试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 动物分组及处理 24只♂ SD大鼠随机分为3组:正常对照组、模型、对照组、褪黑素组，每组8只。各组每日灌胃前禁食6 h，除正常组等量生理盐水灌胃外，其余两组均乙醇灌胃5 g·kg－1，每日1次，连续5 d。褪黑素组在乙醇灌胃1 h后再给予褪黑素50 mg·kg－1灌胃，在末次乙醇灌胃并禁食6 h后将全部大鼠以3%戊巴比妥钠(1 ml·kg－1)麻醉并处死，腹主动脉取血，并取出肝脏。血标本离心后取上清，－20℃冷冻以备生化检测。取新鲜肝右叶1 g，加入9倍体积生理盐水，于冰浴中制成10%(1∶9，W/V)肝匀浆，4℃ 1 420×g离心15 min，取上清－20℃冷冻以备检测SOD活性、MDA含量。在左肝叶同一部位，取一小块肝组织，用10%中性甲醛固定以备病理及免疫组化检查。

1.4 大鼠血清转氨酶活性测定 采用瑞士Roche Modular DPP全自动生化分析仪测定大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。

1.5 肝匀浆MDA含量和SOD活性测定 采用生化方法，按试剂盒说明书进行。

1.6 病理学检查 10%中性甲醛固定肝组织，石蜡包埋并切片，常规HE染色，光镜下观察。

1.7 免疫组化法检测肝组织中TNF-α和IL-1β表达 采用S-ABC法。切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液微波炉中抗原修复，加入一抗(分别为1∶100、1∶300)4℃过夜，加二抗室温下孵育，加试剂SABC，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片。每批实验均设阴性对照，以PBS液代替一抗。其结果判断方法为:以细胞内有明显黄色/棕黄色颗粒判定为阳性细胞。平均光密度(OD)测量:在Nikon E-clipse 8ic显微镜下，每张切片随机选取5个不连续视野(×200)，用Nikon Digital camera摄像并保存待测量图片，Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测OD值，取每张切片平均OD值作为每张切片测量值。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件包处理，计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析(LSD法)。

2 结果

2.1 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST活性的影响 与正常对照组比较，模型对照组血清中ALT、AST活性明显升高。与模型对照组比较，褪黑素组血清ALT、AST活性明显降低(Tab 1)。

Tab 1 Effect of melatonin on serum ALT，AST activities in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(±s，n=8)

Tab 1 Effect of melatonin on serum ALT，AST activities in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(±s，n=8)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs normal group;★P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs model group.

Group ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Normal 63.12 ±13.40 146.12 ±27.34 Model 81.00 ±15.84▲ 196.37 ±31.33▲▲Melatonin 65.25 ±14.87★ 148.00 ±24.50★★

2.2 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠肝匀浆MDA含量、SOD活性的影响 与正常对照组比较，模型对照组肝匀浆中MDA含量明显升高，SOD活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。与模型对照组比较，褪黑素组肝组织匀浆中MDA含量明显降低，SOD活性明显升高(均为 P＜0.05)(Tab 2)。

2.3 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠肝脏病理组织学变化的影响 光镜下可见正常对照组大鼠肝脏无明显病理改变，仅肝小叶内偶见脂肪变性的肝细胞，模型对照组肝细胞肿胀明显，可见较明显脂肪变性，胞质内出现弥漫性的圆形脂滴，肝小叶界限模糊，其内散见肝细胞点状坏死。与模型对照组比较，褪黑素组肝细胞肿胀、脂肪变性有所减轻(Fig 1)。

2.4 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠肝组织中TNF-α和IL-1β表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组中央静脉周围及部分肝小叶内可见较多黄色/棕黄色颗粒沉着，TNF-α和IL-1β OD值较正常对照组明显升高。与模型对照组比较，褪黑素组中央静脉周围及肝小叶内黄色/棕黄色颗粒明显减少，TNF-α和IL-1β OD值较模型对照组明显降低(Tab 3，Fig 2，3)。

Tab 2 Effect of melatonin on MDA content and SOD activity in liver homogenates in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(±s，n=8)

Tab 2 Effect of melatonin on MDA content and SOD activity in liver homogenates in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(±s，n=8)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs normal group;★P ＜0.05 vs model group.

Group MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro Normal 2.24 ±0.70 116.58 ±18.36 Model 3.63 ±0.40▲▲ 90.61 ±23.20▲Melatonin 2.96 ±0.57★ 113.90 ±11.99★

Fig 1 Pathological changes(HE staining，×200).

Fig 2 Expression of TNF-α in liver section taken from rats(SABC ×200).

Fig 3 Expression of IL-1β in liver section taken from rats(SABC×200).

Tab 3 Effect of melatonin on expression of TNF-α and IL-1β in rat liver in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(OD，±s，n=8)

Tab 3 Effect of melatonin on expression of TNF-α and IL-1β in rat liver in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(OD，±s，n=8)

▲▲P ＜0.01 vs normal group;★P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs model group.

Group TNF-α IL-1β Normal 0.193 ±0.032 0.147 ±0.014 Model 0.263 ±0.018▲▲ 0.228 ±0.019▲▲Melatonin 0.235 ±0.011★ 0.187 ±0.020★★

3 讨论

MT对慢性酒精性肝病的防治作用仅见个别报道，对急性酒精性肝病的防治未见报道。本实验中，MT能明显降低急性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST活性，减轻急性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理改变，说明MT对大鼠急性酒精性肝损伤具有改善作用。同时，实验显示，MT能明显降低大鼠肝组织中脂质过氧化产物 MDA的含量，升高抗氧化酶SOD的活性，说明MT不仅能通过直接清除自由基而抗氧化，还能通过提高肝内抗氧化酶活性而抗氧化，亦即间接抗氧化作用，这与以前的研究结果一致［6－7］。

目前认为酒精对肝脏损伤的主要机制有以下几个方面［8－9］:内毒素、氧化应激、细胞因子。肝内蓄积的酒精及其氧化代谢产物可直接刺激机体产生内毒素(LPS)，血液中内毒素升高，激活肝脏Kuffer细胞产生大量核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)和其它转录因子如AP-1、EGR-1，这些转录因子促进活化的肝脏Kuffer细胞转录TNF-α、IL-1，PGE2等炎症因子。其中NF-κB是酒精性肝病中促炎症因子(如TNF-α)表达的关键转录因子之一，而TNF-α是酒精性肝病发生的关键性细胞因子。TNF-α可直接引起肝细胞脂肪变性、炎症及坏死。在大鼠的试验中，抗TNF-α抗体已经显示能阻断酒精诱导的肝损伤的进展，用其治疗酒精性肝炎患者的小规模临床试验正在进行［9］。IL-1β也是酒精性肝病发病过程中的重要的炎症因子，是强致炎因子，可诱导急性时相蛋白产生，还可引起体内致热原增多、诱导IL-8(中性粒细胞的活化及趋化性的刺激因子)产生和促进中性粒细胞浸润等。已有研究发现MT可以抑制NF-κB活性从而影响某些病理过程，体外实验发现MT可抑制Hela细胞增殖，下调Hela细胞NF-κB蛋白水平，考虑其抑制Hela细胞增殖作用可能与下调NF-κB蛋白水平有关［10］;在呼吸道合胞病毒感染的巨噬细胞和溃疡性结肠炎模型中，MT通过抑制 NF-κB活性而降低炎症因子 TNF-α、ICAM-1的表达［11－12］。本实验显示模型组肝组织中TNF-α和IL-1β表达明显增强，MT能明显降低其表达，提示MT能减少酒精性肝损伤时细胞因子的生成，其机制是否为MT通过抑制Kupffer细胞NF-κB活性进而影响TNF-α和IL-1β等细胞因子表达是我们进一步研究的课题。

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