Eu3+对槲皮素与BSA相互作用的影响

张怀斌，张晓帆，李怀祥

(1.滨州医学院(烟台校区)药学院，山东 烟台 264003；2.山东师范大学化学化工与材料科学学院，山东 济南 250014)

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是血浆中含量最丰富的载体蛋白[1]。牛血清白蛋白(BSA)因与人血清白蛋白(HSA)具有相似的结构，常被作为体外模型进行研究[2]。蛋白质分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而产生内源性荧光，因此可为药物与血清白蛋白的结合作用研究提供有用的信息，为研究药物在体内的分布、药效的发挥等提供重要的依据[3，4]。

槲皮素(Quercetin，Que)是自然界广泛分布的一种黄酮类化合物，生物活性显著，具有抗氧化、抗癌、消炎及清除自由基等功效[5]。槲皮素与生物大分子的结合作用已成为研究者关注的焦点，其中针对Que与BSA的结合作用已有相关研究[3～9]。Que 结构中存在3-羟基-4-酮、3′，4′-二羟基、5-羟基-4-酮三个配位点，可与金属离子形成稳定的配位结构[3，4]。研究发现，Zn2+存在下Que与BSA的结合作用减弱；而吕鉴泉等[9]发现Ca2+能够使Que与BSA的结合作用增强。可见，不同金属离子对Que与BSA的结合作用会产生不同的影响。近年来稀土在农业、材料及生物医学等领域的应用日益广泛，稀土在应用过程中对生命体健康的影响成为人们关注的重点[10，11]。

荧光光谱是研究蛋白质与小分子作用的重要手段。当血清白蛋白与某些小分子结合后会导致荧光猝灭，其猝灭机制常根据Stern-Volmer方程[8，9，12]确定：

F0/F=1+KSVcq=1+Kqτ0cq

(1)

式中:F和F0分别为有、无猝灭剂时体系的荧光强度；KSV为Stern-Volmer猝灭常数；cq为猝灭剂的浓度；Kq为荧光猝灭速率常数；τ0为无猝灭剂时生物大分子的平均寿命(约为10-8s)。

在静态猝灭作用中，存在：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgcq

(2)

以lg[(F0-F)/F]对lgcq作图可求得蛋白质与小分子的结合常数KA及结合位点数n，当温度变化不大时，结合反应的焓变△H可看成一个常数，根据热力学公式(3)、(4)可求得结合作用的热力学参数[2，8]。

ln(K2/K1)=△H(1/T1-1/T2)/R

(3)

△G=△H-T△S=-RTlnK

(4)

鉴于此，作者以Que为药物小分子、BSA为药物作用的底物，采用荧光光谱、紫外吸收光谱、红外光谱研究稀土离子Eu3+对Que与BSA结合作用的影响，分析了Eu3+存在下结合作用减弱的原因，拟为其在生物医学领域的研究与应用提供有价值的信息。

1 实验

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白(纯度>98%)、槲皮素(生化试剂)，上海生物工程有限公司；Tris试剂、氯化钠、盐酸、氧化铕，均为分析纯；溶剂为二次去离子水。将氧化铕按化学反应剂量溶于盐酸中，配制成1.0×10-2mol·L-1的EuCl3溶液；用pH值为7.4的0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲溶液(内含0.05 mol·L-1NaCl维持离子强度)配制浓度为1.01×10-6mol·L-1的BSA溶液；配制浓度为1.1×10-4mol·L-1的甲醇水溶液(1∶1，体积比)。

LS-55型荧光分光光度计，美国Perkin Elmer公司；WQF-510 FTIR型傅立叶红外光谱仪，北京瑞利分析仪器公司；756PC型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；XW-80A型旋涡混合器，上海医大仪器厂；PHS-3C型酸度计，上海精密仪器有限公司；DK-S型两孔四列恒温水浴锅，烟台龙口先科仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 荧光光谱测定

取3 mL BSA于石英比色皿中，分别加入不同量的Que(每次加入10 μL，加入总体积<100 μL，忽略体积对浓度的影响)，固定激发波长为285 nm、荧光发射与激发狭缝宽度比为6∶8、扫描速率为500 nm·min-1，分别于温度为299 K、311 K时测定BSA 300～450 nm的发射光谱，记录350 nm处的荧光强度。

在上述溶液中维持Eu3+的浓度分别为1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1，重复上述步骤。

1.2.2 紫外光谱、红外光谱测定

在pH值为7.4的Tris-HCl介质中，测定Eu3+与Que摩尔比为0、1∶3、2∶3、3∶3时的紫外光谱。

Eu3+与Que以摩尔比2∶1混合，静置18 h，用去离子水反复洗涤、离心，干燥后测定红外光谱。

2 结果与讨论

2.1 Eu3+存在下，Que对BSA荧光猝灭的影响

图1A～D分别为Eu3+浓度为0 mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1条件下，Que对BSA荧光光谱猝灭的影响。

cq(×10-8 mol·L-1)，1～6:3.7，7.4，11.1，15.1，18.5，22.2

由图1A可知，BSA的最大发射峰位于350 nm处，随着Que浓度的增大，BSA的荧光强度有规律地降低，最大发射峰从350 nm蓝移至347 nm，BSA的峰形没有发生变化。表明Que与BSA之间发生了结合作用，但没有破坏BSA的发色团。BSA溶液中加入Eu3+后，随着Eu3+浓度的增大，BSA荧光光谱略有蓝移，当Eu3+浓度为1.0×10-4mol·L-1时蓝移0.9 nm(图1D)。Eu3+存在下Que对BSA的荧光猝灭程度减小，发射峰蓝移程度也减小，但峰形没有发生明显变化。说明Eu3+对Que与BSA的结合作用具有一定的影响。

根据Stern-Volmer方程作出Que对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线，如图2所示。

图2 Eu3+存在下，Que与BSA结合作用的Stern-Volmer曲线

由直线的斜率求出299 K时不同Eu3+浓度下Que对BSA的猝灭常数KSV和猝灭速率常数Kq，结果见表1。

表1 不同Eu3+浓度下，Que对BSA的猝灭常数及猝灭速率常数

由表1可以看出，Kq值均远大于动态扩散控制的猝灭速率常数1010L·mol-1·s-1[13]，初步推测静态猝灭在整个猝灭过程中起主导作用；Eu3+的存在，使Que对BSA的猝灭作用减弱，但没有改变Que与BSA的作用机制。

动态猝灭随温度的升高，有效碰撞加剧，猝灭常数增大；静态猝灭则相反[13]。图3为299 K、311 K时Que与BSA结合作用的Stern-Volmer曲线。

图3 不同温度下，Que与BSA结合作用的Stern-Volmer曲线

由图3可以看出，猝灭常数随温度升高而减小，进一步证明静态猝灭在整个过程中占主导作用。

2.2 Eu3+对Que与BSA结合作用及热力学参数的影响

以lg[(F0-F)/F]对lgcq作图，结果见图4；回归方程及299 K时Que与BSA的结合常数KA、结合位点数n、相关系数见表2；不同温度下的热力学参数见表3。

图4 lg[(F0-F)/F]与lgcq的关系

表2 不同Eu3+浓度下，Que与BSA结合的回归方程、结合常数、结合位点数及相关系数(T=299 K)

表3 不同温度下的热力学参数

由表2可以看出，随着Eu3+浓度的增大，Que与BSA的KA及n均逐渐减小，其相关系数也相应减小。说明Eu3+影响了Que与BSA的结合作用。

由表3可以看出，随着温度的升高，不管Eu3+是否存在，Que与BSA的结合常数KA均增大。

2.3 Eu3+存在下Que与BSA结合作用减弱的因素分析

Chen在研究Zn2+对Que与BSA结合作用的影响时指出[3，4]：Zn2+能够使BSA的发射峰显著蓝移及BSA与Que结合作用的猝灭速率常数增大、结合常数减小；Zn2+存在下Que与BSA的结合在很大程度上是Zn2+-Que与BSA的结合作用。而在本实验中，将Eu3+加入到BSA中，BSA的发射峰位置并未发生明显蓝移，当其浓度达到1.0×10-4mol·L-1时，仅蓝移0.9 nm，且Eu3+的存在使得Que对BSA作用时蓝移程度降低(图1)。Eu3+的存在，虽未改变Que对BSA的猝灭机制，但其猝灭常数、猝灭速率常数及结合常数均减小，这说明，Eu3+阻碍了Que与BSA的结合，并未参与协同猝灭。此外，从表2可知，体系中Eu3+浓度的增大，lg[(F0-F)/F]与lgcq之间的相关系数R减小；当Eu3+浓度为1.0×10-4mol·L-1时，R值较大地偏离1.000，这也进一步说明Eu3+的存在影响了Que与BSA的结合作用，当Eu3+浓度增大到一定程度时，有可能改变Que与BSA的作用机制。这些表明Eu3+对Que与BSA结合作用的影响与Zn2+相比有所差别。

Eu3+存在时Que与BSA的结合作用减弱，可能有如下几点原因：

(1)在pH=7.4时，BSA(等电点约为4.6)带有较多负电荷，Eu3+带有3个正电荷，Eu3+与BSA有较强的静电引力，在作用过程中有竞争作用，很大程度上限制了Que与BSA的结合。文献[11]中Eu3+与人血清白蛋白的结合常数为1012L·mol-1，而本实验中Que与BSA的结合常数为105L·mol-1，Eu3+与牛血清白蛋白的结合常数远远大于Que与BSA的结合常数，因此，在Eu3+、Que同时与BSA作用时产生竞争作用，使得Que与BSA的结合常数减小。

(2)Eu3+与BSA的结合及大量的Eu3+分散在BSA外侧，增大了Que与BSA之间的阻力，使二者的结合作用变得困难，要发生同样的作用需要更多的能量。从表3可知：△S>0，分子之间的相互作用力主要为疏水作用力；△G<0，反应可自发进行；△H>0，反应是吸热过程，温度升高有利于反应向正反应进行，因此结合常数随温度升高而增大[14]。Eu3+存在下改变了BSA的结构及微环境，△G虽然仍小于零，但与不存在时相比有所增大，自发进行反应的趋势降低，同时△H、△S有所增大，说明Que与BSA发生相同的变化需要吸收的热量更多，Eu3+存在时，反应熵驱动过程更明显。这进一步证实Eu3+的存在不利于Que与BSA的结合。

(3)有可能生成Eu3+-Que配合物，抑制Que与BSA的结合。Que在紫外区有2个吸收带，分别位于256 nm和375 nm[4]。从pH值为7.4的Tris-HCl介质中不同Eu3+与Que摩尔比的紫外光谱(图5)可以看出，256 nm和375 nm两吸收带分别红移到了290 nm和392 nm，并且在320 nm处出现一弱的吸收峰，这可能与介质溶液及Que的存在形式有关。随着Eu3+浓度的增大，290 nm和392 nm处吸收强度明显减弱，320 nm吸收带增强，290 nm和320 nm吸收带分别红移了4 nm和10 nm，460 nm处出现一新的吸收峰且吸收强度不断增大，在278 nm、352 nm、430 nm处出现3个等吸收点。上述结果显示，在pH值为7.4的Tris-HCl介质溶液中Eu3+与Que极易形成配位结构。

Eu3+ 与Que摩尔比，1～4：0、1∶3、2∶3、3∶3

Eu3+存在下Que的红外光谱(图6)中C=O振动峰、C-OH振动峰的消失均显示有配位结构的形成，进一步证实了Eu3+-Que配合物的生成。Eu3+与Que的结合降低了溶液中Que的浓度，同时Eu3+-Que配合物有可能抑制Que与BSA的作用，从而使得Que与BSA的结合作用减弱。

图6 Eu3+存在下Que的红外光谱

3 结论

在模拟动物体生理条件下，运用荧光光谱、紫外吸收光谱、红外光谱研究了Que与BSA的结合作用。结果表明，Que对BSA的荧光光谱具有猝灭作用，其猝灭机制为静态猝灭，Eu3+的存在使得BSA发射峰蓝移程度降低，猝灭常数、结合常数、结合位点数均减小，但没有改变Que与BSA的作用机制。在较大浓度Eu3+存在下，Que与BSA结合作用的相关系数减小。分析认为，Eu3+与Que在与BSA结合上存在竞争作用，Eu3+与BSA有较强的静电引力，过量的Eu3+分散在BSA外侧，增大了Que与BSA之间的阻力，要发生同样的反应吸收的热量更多；另外，在Que结构中存在配位点，可与金属离子形成稳定的配位结构，可能生成的Eu3+-Que配合物抑制了Que与BSA的结合。因此，Que与BSA的结合作用减弱是多种因素作用导致的。为研究Eu3+的生物医学效应及Eu3+存在下Que的药理、毒理作用提供了重要信息。

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