从RNA酶解液中分离5′-尿苷酸

李德莹，丁庆豹

(1.三峡大学化学与生命科学学院，湖北 宜昌 443002；2.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

核苷、核苷酸是构成生物遗传信息DNA和RNA的基础，在生物细胞的物质代谢和能量转换中起着重要作用。核酸的分解产物及其衍生物在食品、医药和保健领域应用广泛[1～3]。核苷酸类物质的应用源于5′-肌苷酸呈鲜味性质的发现，20世纪70年代以来，核苷酸及其衍生物在抗病毒和抗癌方面受到医药界的普遍重视，现在普遍使用的利巴韦林、齐多夫定、拉米夫定、氟铁龙等均为核苷酸的衍生物。其中尿苷酸(UMP)参与肝解毒物质葡萄糖醛酸酐的生物合成，用于治疗肝炎，还可作为生产核酸类药物、保健食品及生化试剂的中间体，如用于合成尿苷三磷酸(UTP)、聚腺尿、氟铁龙等药物。

传统的UMP制备方法通常是先采用1根阳离子交换柱分离4种单核苷酸[4～6]，分别得到UMP、胞苷酸(CMP)、腺苷酸(AMP)的稀溶液和鸟苷酸(GMP)、CMP的混合液；再将UMP调pH值后，上阴柱分离纯化、浓缩。该法存在树脂利用率低、4种核苷酸不易完全分离、UMP的质量较差、分离周期较长、环境温度较高时上柱液容易滋生微生物等问题；若要进行工业化生产，还需要增加洗脱液贮罐[7]。肖林平[8]研究了一种新的阳离子交换树脂，可以将4种核苷酸在该阳柱上分离，但各产品色谱峰之间几乎没有距离，导致流出液产品收集存在一定困难。

作者在此采用串联的阳离子交换柱在酸性条件下首先吸附AMP、CMP和GMP，未经吸附的UMP流经弱碱性树脂柱和强碱性树脂柱后，经洗脱、浓缩、干燥，得到高纯度的UMP。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

麦芽根、酵母RNA，上海线磊生物科技有限公司；001×8、D301、D312、717树脂，华东理工大学华震公司；实验用试剂均为市售化学纯。

紫外分析仪，752型紫外可见分光光度计，超级恒温水浴，酸度计，岛津高效液相色谱仪。

1.2 方法

利用麦芽根内提取的磷酸二酯酶作用于酵母RNA，可同时获得4种5′-单核苷酸，即5′-腺苷酸(AMP)、5′-胞苷酸(CMP)、5′-鸟苷酸(GMP)和5′-尿苷酸(UMP)。AMP、CMP、GMP在pH值1.5时所带的正电荷不同，强弱顺序依次为AMP>CMP>GMP；UMP因为没有氨基解离，带负电荷，从而不被阳离子树脂吸附而直接从柱上流出。因此，首先用阳离子树脂吸附AMP、CMP和GMP，从而将UMP单独分离出来。

1.2.1 磷酸二酯酶的制备[9，10]

称取100 g麦芽根(金黄色，无异味，杂质少)，加入800 mL去离子水，于室温(低于25 ℃)浸泡16 h后，置于组织捣碎机粉碎，用尼龙布挤出浸汁，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 酵母RNA的酶解

将200 mL磷酸二酯酶酶液加到2 L 1%的酵母RNA溶液中，于70 ℃搅拌反应2 h，反应停止后，迅速升温至90 ℃，加入少量硅藻土、活性炭过滤，滤液经超滤处理。

1.2.3 UMP的分离

采用4柱串联的方法。即2根阳柱与2根阴柱串联，其中1#与2#柱装填强酸性阳离子交换树脂001×8、3#柱装填大孔弱碱性阴离子交换树脂D312、4#柱装填强碱性阴离子交换树脂717。将酵母RNA酶解液依次经过4柱处理后，用2 mol·L-1的HCl调pH值为1.5。

1.3 分析检测

1.3.1 5′-核苷酸的鉴定

1.3.1.1 比值分析

将洗脱液的吸光度比值(A250/A260、A280/A260)与文献值比较，定性判断核苷酸种类[11]。4种核苷酸的标准吸光度比值见表1。

表1 4种核苷酸的吸光度比值

1.3.1.2 琼脂糖电泳

取适量琼脂糖水浴加热溶解，加入pH值3.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液，混匀，趁热吸取3.7 mL铺在2.5 cm×7.5 cm的白料玻璃板上。冷却凝固后距一端1.5 cm处开一狭缝，注入样品液，以点样处为负极，电压约300 V，于电泳仪上电泳5 min。将电泳后的琼脂糖凝胶板移入紫外分析仪中观察。

1.3.2 5′-核苷酸的纯度分析

采用高效液相色谱仪测定洗脱流出液中4种核苷酸的浓度[12，13]。色谱条件如下：Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6 mm×150 mm)；流动相为pH值5.5的0.05 mol·L-1乙酸胺溶液；流速1 mL·min-1；紫外检测波长254 nm；柱压5.8 MPa。

1.3.3 UMP的收率计算

2 结果与讨论

2.1 UMP的阳柱分离

将1800 mL RNA酶解液按序通过1#、2#串联柱，1#装柱量为250 mL，2#装柱量为380 mL，流速约200～250 mL·h-1。检测2#柱出口，经吸光度比值分析，上样时阳柱的流出液为UMP；上样完毕后，阳柱中还残留有少量的UMP，用0.01 mol·L-1的HCl洗柱，流速200～250 mL·h-1。流出曲线如图1所示。

图1 UMP流出曲线

由图1可知，流出液体积约2 L后，260 nm下的吸光度值很小，意味着柱出口处未检测到核苷酸。在随后的继续洗脱过程中，经过一段空白后，2#柱出口处得到GMP。经HPLC分析，收集的1.8 L流出液中仅可检测出UMP，未检测出其它3种核苷酸，这表明使用1.8 L强酸性阳离子交换树脂可以将UMP与其它核苷酸分离。因此可采用4柱串联方式，将残留在1#、2#、3#柱中的5′-UMP全部洗至4#柱，控制操作条件将AMP保留在1#柱，CMP、GMP保留在2#柱，便于其分离。

2.2 UMP流出液的阴柱纯化与浓缩

通过琼脂糖电泳分析阳柱流出液，发现在UMP的前端(正极端)仍有两条明显的杂质带，说明RNA酶解液中含有比UMP带有更多负电荷的物质，在阳柱分离的过程中，这些物质与UMP一起流出。若直接对UMP流出液进行阴离子交换树脂浓缩，对后期UMP的结晶影响较大，几乎得不到UMP的结晶。考虑到主要杂质所带的负电荷明显大于UMP，采用弱碱性的大孔阴离子交换树脂(3#柱)对这些物质进行吸附，并用0.01 mol·L-1HCl洗脱吸附在弱碱性阴离子交换树脂上的UMP。经此处理，UMP流出液电泳只有一条带，无明显的杂质带，且后期得到晶形非常好的固体UMP。

2.2.1 3#柱树脂种类与用量的选择

3#柱采用大孔弱碱性阴离子交换树脂D301，装柱量为100 mL；4#柱采用强碱性阴离子交换树脂717，装柱量为100 mL。3#柱的作用一方面是对含有杂质的UMP流出液进行纯化，另一方面是起到调节pH值的作用。UMP在pH值较高时，其磷酸基和烯醇式基团均解离带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附，在pH值2.0～2.5范围内上述基团离解度降低。而阳柱流出液的pH值为1.0～1.5，此时UMP是不可能被阴离子交换树脂吸附的，但是当其通过大孔阴离子交换树脂后，溶液的pH值会升高到9.0～11.0。因此，3#柱的离子交换树脂种类与装柱量是关键的因素。

当3#柱的树脂量为100 mL时，将1800 mL RNA酶解液按序通过1#、2#、3#、4#串联柱，结果发现4#柱的流出液中UMP漏穿，检测漏穿时3#柱的出口pH值为1.5，说明3#柱的树脂量偏低。于是将3#柱的树脂量增加到150 mL，漏穿现象仍然发生，此时，3#、4#柱的出口pH值变化见图2。

图2 3#、4#柱的出口pH值(3#柱的树脂量为150 mL)

由图2可见，在流出体积为1600 mL时，3#柱的出口pH值迅速降到2.5以下，说明3#柱的树脂量仍然偏低，对pH值的缓冲能力达不到要求。

将3#柱的树脂量增加到200 mL，并改用交换容量比较大的D312树脂，检测3#柱出口pH值为8.5，4#柱出口pH值为7.0，流出液中UMP未漏穿，但有部分UMP被吸附到3#柱。采用pH值2.0的稀盐酸溶液洗涤3#柱，可将UMP全部洗出，而杂质全部留在3#柱。3#柱树脂种类及用量对UMP纯化的影响见表2。

表2 3#柱树脂种类及用量对UMP纯化的影响

由表2可知，采用D312树脂，装柱量为200 mL时的纯化效果最好，UMP收率高达92.1%。

2.2.2 4#柱洗脱剂的选择

若4#柱未漏穿，则采用0.01 mol·L-1HCl洗柱，将UMP全部洗至4#柱，然后断开3#柱与4#柱，对4#柱进行洗脱。分别采用0.01 mol·L-1HCl、0.03 mol·L-1HCl作为洗脱剂，发现洗脱液体积过大，洗脱液中杂质含量较高。改用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl洗脱4#柱，洗脱曲线见图3。

图3 4#柱UMP洗脱曲线

洗脱所得到的UMP的吸光度比值与标准品的相比有一些偏差，这可能是因为洗脱剂的离子强度较高，将一些吸附较牢的杂质也洗脱下来的缘故。因此，降低NaCl浓度至0.2 mol·L-1进行洗脱，结果见表3。

表3 洗脱剂对UMP纯化的影响

由表3可见，用0.01 mol·L-1HCl-0.2 mol·L-1NaCl洗脱下的UMP吸光度比值与用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl的吸光度比值接近，说明降低NaCl浓度对提高其洗脱选择性并未起到明显作用，但前者洗脱液总体积为390 mL，相比于后者洗脱液总体积300 mL，增加幅度较大，对后续的乙醇结晶不利。因此，选用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl作为洗脱剂，虽然所得溶液中含有杂质，但经琼脂糖电泳分析其含量非常少，而且分离后的结晶也是一个纯化过程，极少量的杂质不会沉淀出来。

收集液加入少量糖用活性炭，60 ℃水浴保温30 min，用砂芯漏斗过滤，然后调pH值至7.0～7.5。加入3 BV 95%的乙醇，搅拌、静置后用无水乙醇洗涤，真空干燥即得固体UMP，纯度达86%以上。

3 结论

先采用2根强酸性阳离子交换柱串联操作，使得AMP保留在1#柱，可以有效解决洗脱液用量过多、浓度低的问题；再采用大孔弱碱性阴离子交换树脂，有效去除阳柱分离时上柱流出液中的杂质，并自动调节4#柱的pH值使其有利于UMP吸附；最后直接从4#柱洗脱得到纯度较高的UMP，结晶纯度达86%以上，收率92.1%。缩短了分离周期，节省了设备成本。

[1] Brunser O，Espinoza J，Araya M，et al.Effect of dietary nucleotide supplementation on diarrhoeal disease in infants[J].Acta Paedia，1994，83(2)：188-191.

[2] Carver J D.Dietary nucleotides：Effects on the immune and gastrointestinal systems[J].Acta Paediatr Suppl，1999，88(430)：83-88.

[3] 郭小兵，乐国伟，施用晖.外源核苷酸对婴幼儿的营养作用及其在代乳品中的应用[J].食品科技，2000，(5)：17-25.

[4] Laufer Louis，Gutcho Sidney.Hydrolysis of RNA to 5′-nucleotide by seed sprouts，particularly malt sprouts[J].Biotechnology and Bioengineering，1968，10(3)：257-275.

[5] Benaiges M D，Lopez-Santin J，Sola C.Production of 5′-ribonucleotides by enzymatic hydrolysis of RNA[J].Enzyme Microb Technol，1990，12(2)：86-89.

[6] Deoda A J，Singhal R S.5′-Phosphodiesterase(5′-PDE) from germinated barley for hydrolysis of RNA to produce flavour nucleotides[J].Bioresource Technology，2003，88(3)：245-250.

[7] 杨翠竹.5′-核苷酸制备工艺的优化[D].石家庄：河北科技大学，2007.

[8] 肖林平.5′-尿甘酸分离纯化工艺的研究[D].南京：南京工业大学，2003.

[9] Tanaka Hidao，Hirao Chiemi，Semba H，et al.Release of intracellularly stored 5′-phosphodiesterase with preserved plant cell viability[J].Biotechnology and Bioengineering，1985，27(6)：890-892.

[10] Dhule Santosh S，Shetty Premalata R，Iyer Jyoti L，et al.Purification and characterization of 5′-phosphodiesterase from germinated barley[J].Process Biochemistry，2006，41(8)：1899-1902.

[11] 中国科学院微生物研究所.核苷酸类物质的生产和应用[M].北京：科学出版社，1971:27.

[12] Pon Richard T，Ogilvie Kelvin K.Simultaneous analysis of nucleosides and nucleotides by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography，1981，205(1)：202-205.

[13] 张燕婉，鲁红军，王津生.高效液相色谱法测定食品中核苷酸的含量[J].食品科学，1994，(6)：59-62.