李德莹,丁庆豹
(1.三峡大学化学与生命科学学院,湖北 宜昌 443002;2.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237)
核苷、核苷酸是构成生物遗传信息DNA和RNA的基础,在生物细胞的物质代谢和能量转换中起着重要作用。核酸的分解产物及其衍生物在食品、医药和保健领域应用广泛[1~3]。核苷酸类物质的应用源于5′-肌苷酸呈鲜味性质的发现,20世纪70年代以来,核苷酸及其衍生物在抗病毒和抗癌方面受到医药界的普遍重视,现在普遍使用的利巴韦林、齐多夫定、拉米夫定、氟铁龙等均为核苷酸的衍生物。其中尿苷酸(UMP)参与肝解毒物质葡萄糖醛酸酐的生物合成,用于治疗肝炎,还可作为生产核酸类药物、保健食品及生化试剂的中间体,如用于合成尿苷三磷酸(UTP)、聚腺尿、氟铁龙等药物。
传统的UMP制备方法通常是先采用1根阳离子交换柱分离4种单核苷酸[4~6],分别得到UMP、胞苷酸(CMP)、腺苷酸(AMP)的稀溶液和鸟苷酸(GMP)、CMP的混合液;再将UMP调pH值后,上阴柱分离纯化、浓缩。该法存在树脂利用率低、4种核苷酸不易完全分离、UMP的质量较差、分离周期较长、环境温度较高时上柱液容易滋生微生物等问题;若要进行工业化生产,还需要增加洗脱液贮罐[7]。肖林平[8]研究了一种新的阳离子交换树脂,可以将4种核苷酸在该阳柱上分离,但各产品色谱峰之间几乎没有距离,导致流出液产品收集存在一定困难。
作者在此采用串联的阳离子交换柱在酸性条件下首先吸附AMP、CMP和GMP,未经吸附的UMP流经弱碱性树脂柱和强碱性树脂柱后,经洗脱、浓缩、干燥,得到高纯度的UMP。
麦芽根、酵母RNA,上海线磊生物科技有限公司;001×8、D301、D312、717树脂,华东理工大学华震公司;实验用试剂均为市售化学纯。
紫外分析仪,752型紫外可见分光光度计,超级恒温水浴,酸度计,岛津高效液相色谱仪。
利用麦芽根内提取的磷酸二酯酶作用于酵母RNA,可同时获得4种5′-单核苷酸,即5′-腺苷酸(AMP)、5′-胞苷酸(CMP)、5′-鸟苷酸(GMP)和5′-尿苷酸(UMP)。AMP、CMP、GMP在pH值1.5时所带的正电荷不同,强弱顺序依次为AMP>CMP>GMP;UMP因为没有氨基解离,带负电荷,从而不被阳离子树脂吸附而直接从柱上流出。因此,首先用阳离子树脂吸附AMP、CMP和GMP,从而将UMP单独分离出来。
1.2.1 磷酸二酯酶的制备[9,10]
称取100 g麦芽根(金黄色,无异味,杂质少),加入800 mL去离子水,于室温(低于25 ℃)浸泡16 h后,置于组织捣碎机粉碎,用尼龙布挤出浸汁,置于4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 酵母RNA的酶解
将200 mL磷酸二酯酶酶液加到2 L 1%的酵母RNA溶液中,于70 ℃搅拌反应2 h,反应停止后,迅速升温至90 ℃,加入少量硅藻土、活性炭过滤,滤液经超滤处理。
1.2.3 UMP的分离
采用4柱串联的方法。即2根阳柱与2根阴柱串联,其中1#与2#柱装填强酸性阳离子交换树脂001×8、3#柱装填大孔弱碱性阴离子交换树脂D312、4#柱装填强碱性阴离子交换树脂717。将酵母RNA酶解液依次经过4柱处理后,用2 mol·L-1的HCl调pH值为1.5。
1.3.1 5′-核苷酸的鉴定
1.3.1.1 比值分析
将洗脱液的吸光度比值(A250/A260、A280/A260)与文献值比较,定性判断核苷酸种类[11]。4种核苷酸的标准吸光度比值见表1。
表1 4种核苷酸的吸光度比值
1.3.1.2 琼脂糖电泳
取适量琼脂糖水浴加热溶解,加入pH值3.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液,混匀,趁热吸取3.7 mL铺在2.5 cm×7.5 cm的白料玻璃板上。冷却凝固后距一端1.5 cm处开一狭缝,注入样品液,以点样处为负极,电压约300 V,于电泳仪上电泳5 min。将电泳后的琼脂糖凝胶板移入紫外分析仪中观察。
1.3.2 5′-核苷酸的纯度分析
采用高效液相色谱仪测定洗脱流出液中4种核苷酸的浓度[12,13]。色谱条件如下:Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6 mm×150 mm);流动相为pH值5.5的0.05 mol·L-1乙酸胺溶液;流速1 mL·min-1;紫外检测波长254 nm;柱压5.8 MPa。
1.3.3 UMP的收率计算
将1800 mL RNA酶解液按序通过1#、2#串联柱,1#装柱量为250 mL,2#装柱量为380 mL,流速约200~250 mL·h-1。检测2#柱出口,经吸光度比值分析,上样时阳柱的流出液为UMP;上样完毕后,阳柱中还残留有少量的UMP,用0.01 mol·L-1的HCl洗柱,流速200~250 mL·h-1。流出曲线如图1所示。
图1 UMP流出曲线
由图1可知,流出液体积约2 L后,260 nm下的吸光度值很小,意味着柱出口处未检测到核苷酸。在随后的继续洗脱过程中,经过一段空白后,2#柱出口处得到GMP。经HPLC分析,收集的1.8 L流出液中仅可检测出UMP,未检测出其它3种核苷酸,这表明使用1.8 L强酸性阳离子交换树脂可以将UMP与其它核苷酸分离。因此可采用4柱串联方式,将残留在1#、2#、3#柱中的5′-UMP全部洗至4#柱,控制操作条件将AMP保留在1#柱,CMP、GMP保留在2#柱,便于其分离。
通过琼脂糖电泳分析阳柱流出液,发现在UMP的前端(正极端)仍有两条明显的杂质带,说明RNA酶解液中含有比UMP带有更多负电荷的物质,在阳柱分离的过程中,这些物质与UMP一起流出。若直接对UMP流出液进行阴离子交换树脂浓缩,对后期UMP的结晶影响较大,几乎得不到UMP的结晶。考虑到主要杂质所带的负电荷明显大于UMP,采用弱碱性的大孔阴离子交换树脂(3#柱)对这些物质进行吸附,并用0.01 mol·L-1HCl洗脱吸附在弱碱性阴离子交换树脂上的UMP。经此处理,UMP流出液电泳只有一条带,无明显的杂质带,且后期得到晶形非常好的固体UMP。
2.2.1 3#柱树脂种类与用量的选择
3#柱采用大孔弱碱性阴离子交换树脂D301,装柱量为100 mL;4#柱采用强碱性阴离子交换树脂717,装柱量为100 mL。3#柱的作用一方面是对含有杂质的UMP流出液进行纯化,另一方面是起到调节pH值的作用。UMP在pH值较高时,其磷酸基和烯醇式基团均解离带负电荷,可被阴离子交换树脂所吸附,在pH值2.0~2.5范围内上述基团离解度降低。而阳柱流出液的pH值为1.0~1.5,此时UMP是不可能被阴离子交换树脂吸附的,但是当其通过大孔阴离子交换树脂后,溶液的pH值会升高到9.0~11.0。因此,3#柱的离子交换树脂种类与装柱量是关键的因素。
当3#柱的树脂量为100 mL时,将1800 mL RNA酶解液按序通过1#、2#、3#、4#串联柱,结果发现4#柱的流出液中UMP漏穿,检测漏穿时3#柱的出口pH值为1.5,说明3#柱的树脂量偏低。于是将3#柱的树脂量增加到150 mL,漏穿现象仍然发生,此时,3#、4#柱的出口pH值变化见图2。
图2 3#、4#柱的出口pH值(3#柱的树脂量为150 mL)
由图2可见,在流出体积为1600 mL时,3#柱的出口pH值迅速降到2.5以下,说明3#柱的树脂量仍然偏低,对pH值的缓冲能力达不到要求。
将3#柱的树脂量增加到200 mL,并改用交换容量比较大的D312树脂,检测3#柱出口pH值为8.5,4#柱出口pH值为7.0,流出液中UMP未漏穿,但有部分UMP被吸附到3#柱。采用pH值2.0的稀盐酸溶液洗涤3#柱,可将UMP全部洗出,而杂质全部留在3#柱。3#柱树脂种类及用量对UMP纯化的影响见表2。
表2 3#柱树脂种类及用量对UMP纯化的影响
由表2可知,采用D312树脂,装柱量为200 mL时的纯化效果最好,UMP收率高达92.1%。
2.2.2 4#柱洗脱剂的选择
若4#柱未漏穿,则采用0.01 mol·L-1HCl洗柱,将UMP全部洗至4#柱,然后断开3#柱与4#柱,对4#柱进行洗脱。分别采用0.01 mol·L-1HCl、0.03 mol·L-1HCl作为洗脱剂,发现洗脱液体积过大,洗脱液中杂质含量较高。改用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl洗脱4#柱,洗脱曲线见图3。
图3 4#柱UMP洗脱曲线
洗脱所得到的UMP的吸光度比值与标准品的相比有一些偏差,这可能是因为洗脱剂的离子强度较高,将一些吸附较牢的杂质也洗脱下来的缘故。因此,降低NaCl浓度至0.2 mol·L-1进行洗脱,结果见表3。
表3 洗脱剂对UMP纯化的影响
由表3可见,用0.01 mol·L-1HCl-0.2 mol·L-1NaCl洗脱下的UMP吸光度比值与用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl的吸光度比值接近,说明降低NaCl浓度对提高其洗脱选择性并未起到明显作用,但前者洗脱液总体积为390 mL,相比于后者洗脱液总体积300 mL,增加幅度较大,对后续的乙醇结晶不利。因此,选用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl作为洗脱剂,虽然所得溶液中含有杂质,但经琼脂糖电泳分析其含量非常少,而且分离后的结晶也是一个纯化过程,极少量的杂质不会沉淀出来。
收集液加入少量糖用活性炭,60 ℃水浴保温30 min,用砂芯漏斗过滤,然后调pH值至7.0~7.5。加入3 BV 95%的乙醇,搅拌、静置后用无水乙醇洗涤,真空干燥即得固体UMP,纯度达86%以上。
先采用2根强酸性阳离子交换柱串联操作,使得AMP保留在1#柱,可以有效解决洗脱液用量过多、浓度低的问题;再采用大孔弱碱性阴离子交换树脂,有效去除阳柱分离时上柱流出液中的杂质,并自动调节4#柱的pH值使其有利于UMP吸附;最后直接从4#柱洗脱得到纯度较高的UMP,结晶纯度达86%以上,收率92.1%。缩短了分离周期,节省了设备成本。
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