提取方法和溶剂对石榴皮中抑菌成分提取的影响

汝绍刚，崔 波，迟玉霞，朱 政，朱庆书，赵文英

(1.青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042；2.枣庄职业学院，山东 枣庄 277800； 3.山东食品药品职业学院，山东 淄博 255000)

石榴为石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，其根、叶、花、果实、果皮、种子均可入药，具有广泛的药用价值。研究表明，石榴所具有的抗癌、降血糖、免疫调节、改善心血管系统等功效主要与石榴皮中所含的鞣质类成分有关[1]。

在中草药提取研究中，许多先进的提取技术越来越受到重视。如微波提取法具有耗时短、对极性分子的选择性加热从而将其选择性地溶出、受溶剂亲和力的限制较小、安全可靠、无污染等特点[2]；超声波提取法具有温度低、耗时短、效率高、不受中药材成分性质限制、提取液杂质少、简单易行等特点[3]。

作者采用不同溶剂比较了微波提取法、超声波提取法、加热回流提取法对石榴皮抑菌成分的提取效果，并对各提取物的抑菌活性进行了研究，拟为选择适宜的提取石榴皮抑菌成分方法提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

石榴皮，购于山东枣庄。

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)由青岛科技大学药学系药剂实验室提供；蛋白胨，天津巴斯夫化工有限公司；牛肉膏，国药集团化学试剂有限公司；琼脂，青岛冻粉厂；氯化钠及其它试剂均为分析纯。

RE-52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；KQ-100型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，苏州净化仪器有限公司；RXZ智能型人工气候箱，宁波科技园新江南仪器有限公司。

1.2 石榴皮中鞣质的提取

1.2.1 微波提取法

取粉碎的石榴皮适量，放入烧杯中，按1∶20(g∶mL，下同)的料液比加入适量溶剂，中低火微波加热30 s，冷却一段时间再继续加热，共加热提取10 min，过滤，滤液经旋转蒸发浓缩至干，加水稀释，用紫外分光光度法测定其中鞣质的含量。

1.2.2 超声波提取法

取粉碎的石榴皮适量，放入具塞锥形瓶中，按1∶20的料液比加入适量溶剂，浸泡2 h，放入超声波清洗器中，40 ℃提取30 min后，过滤，滤液经旋转蒸发浓缩至干，加水稀释，用紫外分光光度法测定其中鞣质的含量。

1.2.3 加热回流提取法

取粉碎的石榴皮适量，放入烧瓶中，按1∶20的料液比加入适量溶剂，置水浴上保持微沸，回流提取2 h后，过滤，滤液经旋转蒸发浓缩至干，加水稀释，用紫外分光光度法测定其中鞣质的含量。

1.3 抑菌实验[4]

以牛肉膏蛋白胨作培养基(培养基须在1.05 kg·cm-2、121.3 ℃下灭菌30 min)，在无菌条件下用灭菌的打孔器在制成的固体培养基平板上打孔，用灭菌的吸管分别吸取配好的样品溶液，以乙醇为空白，注满琼脂孔。将培养皿放在培养箱中，37 ℃培养48 h后，测量抑菌圈直径，比较抑菌效果。

1.4 鞣质含量的测定[5]

1.4.1 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度；精密量取5 mL，置50 mL棕色瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得0.05 mg·mL-1没食子酸对照品溶液。

1.4.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼酸试液1.0 mL，再分别加水11.5 mL、11.0 mL、10.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL，加29% 碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min。以相应的试剂为空白，采用紫外分光光度法在760 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

拟合得到线性回归方程：y=94.299x+0.0013(R=0.9995)，表明没食子酸在0.01～0.001 mg·mL-1范围线性关系良好。

1.4.3 样品溶液的制备

精密量取一定体积挥去溶剂的石榴皮提取液，用水稀释至一定倍数，摇匀，即得。

1.4.4 鞣质含量的测定

总酚：精密量取样品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法，自“加入磷钼酸试液1.0 mL”起，加水10 mL，测定吸光度。

不被吸收的多酚：精密量取样品溶液25 mL，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞锥形瓶中，密塞，置(30±2) ℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出放冷，滤过，弃去初滤液；精密吸取续滤液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法，自“加入磷钼酸试液1.0 mL”起，加水10 mL，测定吸光度。

从标准曲线中读出样品中没食子酸的量(mg)，按下式计算鞣质含量：

鞣质=总酚-不被吸收的多酚

2 结果与讨论

2.1 提取方法和溶剂对提取率的影响

分别以水、40%乙醇、60%乙醇、丙酮为溶剂，采用微波提取法、超声波提取法、加热回流提取法提取石榴皮中鞣质，结果见表1。

表1 提取方法和溶剂对石榴皮中鞣质提取率的影响

从表1可以看出，3种提取方法的最高提取率相差不大，但最适宜的提取溶剂略有差别。微波提取法和超声波提取法都在采用丙酮作溶剂时提取率较高，而加热回流提取法在采用60%乙醇作溶剂时提取率较高。这是因为，一方面，微波提取是通过微波加热产生热效应，使细胞内提取溶剂温度迅速升高，液态溶剂汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，使细胞外液容易进入细胞内，溶解并释放细胞内有效成分；超声波提取则需要细胞内的溶剂吸收超声波能量，然后通过产生的热效应、机械效应和空化效应促使细胞破裂，使细胞中的有效成分进入溶剂，这两种提取方法都需要提取溶剂先进入细胞内。另一方面，在4种提取溶剂中，丙酮的粘度最小，容易渗透到细胞内部，通过微波或超声波作用使细胞破裂，因而提取率较高；加热回流提取主要遵循“相似相溶”原理，由于鞣质结构中含有酚羟基，极性较大，在丙酮中溶解性较小，因而提取率较低。

2.2 提取物抑菌效果比较

将采用不同溶剂、不同提取方法得到的石榴皮提取物进行抑菌实验，结果见表2。

表2 不同提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果/mm

从表2可以看出，微波提取物和超声波提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，加热回流提取物的抑菌效果较差。这可能是因为，微波提取法和超声波提取法的提取时间短，对抑菌成分活性破坏小，而加热回流提取法的提取时间长，易使鞣质结构中的酚羟基发生氧化，影响其抑菌效果。

各种提取物的抑菌效果与提取率的高低并不一致：

(1)在微波提取过程中，以60%乙醇为溶剂时的提取物对大肠杆菌的抑菌效果最好；对于金黄色葡萄球菌则以丙酮提取物效果最好，但两者相差不大。综合考虑提取率与抑菌效果，选择60%乙醇为微波提取时的适宜提取溶剂。

(2)在超声波提取过程中，对大肠杆菌来说，60%乙醇和丙酮提取物的抑菌活性基本相同；对金黄色葡萄球菌来说，60%乙醇和丙酮提取物的抑菌活性也相差不大。因此，选择60%乙醇为超声波提取时的适宜提取溶剂。

(3)在加热回流提取过程中，40%乙醇和60%乙醇的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性基本相同，但从经济角度考虑，选择40%乙醇为加热回流提取时的适宜提取溶剂。

3 结论

分别以水、40%乙醇、60%乙醇、丙酮4种溶剂，采用微波提取法、超声波提取法和加热回流提取法提取石榴皮中的鞣质，考察了提取方法和溶剂对提取率和提取物抑菌效果的影响。通过比较发现，微波提取法和超声波提取法的最高提取率与加热回流提取法相差不大；但从抑菌效果来看，前两种提取方法中，60%乙醇提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用更强，并且微波提取法和超声波提取法相对于加热回流提取法具有简单易行、耗时短、操作方便、效率高等特点，适合于中药提取。

[1] 李云峰，郭长江，杨继军，等.石榴皮抗氧化物质的提取及其体外抗氧化作用研究[J].营养学报，2004，26(2)：143-147.

[2] 陈业高，海丽娜，毕先钧.微波辐射在天然药用活性成分提取分离中的应用[J].微波学报，2003，19(2)：85-89.

[3] 赵兵，王玉春，欧阳藩，等．超声波在植物提取中的应用[J]．中草药，1999，30(9)：附1-3.

[4] 药理学实验编写组.药理学实验[M].北京：人民卫生出版社，1985：117-118.

[5] 王克英，左宏笛，杨理明.紫外分光光度法测定石榴皮中总鞣质含量[J].贵阳中医学院学报，2007，29(6)：66-67.