4种牙本质粘结剂对牙髓成纤维细胞毒性作用的比较

淦 劲，王 婷，梁 燕

(1.市人民医院，贵州 遵义 561003;2.市口腔医院，贵州 贵阳 550002;3.贵阳医学院附属医院，贵州 贵阳 550004)

牙本质粘结剂(dentin bonding agents，DBA)是一种牙体粘结材料，其作用是提高树脂与牙体组织之间的粘结力，减少牙本质－树脂间的微渗漏，分散咬合压力［1］，牙本质粘结体系(dentin adhesive system，DAS)从全酸蚀系统到自酸蚀系统，从传统的三步法到目前常用的一步法，操作步骤不断简化，临床应用日益广泛［2］。生物材料必须具有良好的生物安全性，体外细胞毒性实验是其中的一个重要环节。牙科材料在口腔唾液的作用下，有部分成分会溶解释放出来，有实验证明:此类释放物可造成人牙髓细胞的损伤［3］，因此，牙本质粘结剂细胞毒性的研究就显得很有必要。本研究通过观察4种第7代牙本质粘结剂对牙髓成纤维细胞的毒性作用，初步探讨其生物安全性。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

牙本质粘结剂:G－Bond(GC.美国.INC)、i－Bond (HeraeusKulzer)、xeno V (Dentsply Caulk)、Clearfil S3Bond(Kuraray Medical INC，日本);高糖DMEM培养基(Hyclone，美国);胎牛血清(杭州四季青);MTT、二甲基亚砜(北京索莱宝);CO2培养箱(Thermo公司，3111型);超净工作台(苏州净化有限公司);全自动酶联免疫检测仪(BIO－RAD，680型，美国);倒置相差显微镜(尼康，TE2000－U，杭州 U+DXM1200)。

1.2 方法

采用组织块培养法原代培养人牙髓成纤维细胞，采用四甲基偶氮唑盐比色法和测试不同浓度、浸提时间的材料浸提液的体外细胞毒性实验(MTT)法，盲法观察4 种新一代牙本质粘结剂(G－Bond、i－Bond、xeno V、Clearfil S3Bond)的不同体积分数浸提液(12.5%、25%、50%、100%)在不同时间(24、48、72 h)对第 5代人牙髓成纤维细胞的毒性作用。

1.2.1 人牙髓成纤维细胞原代培养和鉴定

采用组织块法常规培养人牙髓成纤维细胞。取14～20岁因正畸减数拔除的无龋前磨牙，在超净工作台内取出牙髓组织，用PBS缓冲液冲洗后，去除根尖3 mm，将余留牙髓组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎块，加入含体积分数为100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液2.5 mL，于37℃、50 mL/L C02条件下培养，3～5 d换液。待细胞爬满瓶底时，进行传代，取第4代细胞用细胞免疫化学染色SP法进行细胞来源鉴定。

1.2.2 牙本质粘结剂浸提液的制备

采用盲法将4种牙本质粘结剂编号为材料1(G－Bond)、材料 2(i－Bond)、材料 3(clearfils3Bond)、材料4(xeno V)，然后按其使用说明，分别涂抹于盖玻片(18 mm×18 mm)一面，光照固化，紫外线照射24 h灭菌后置无菌试管中，以浸提液量与试样表面积比为2.5 mL/cm2的比例加入DMEM培养液，置37℃、50 mL/L C02培养箱中浸提24 h。所得各材料浸提原液经微滤器过滤后，再分别用DMEM培养液稀释，使其终末体积分数分别为原液的 50%、25%、12.5%。

1.2.3 细胞毒性检测(MTT法)

采用酶消化法收集第5代呈对数生长的人牙髓成纤维细胞，加入含体积分数为100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打，制成细胞悬液，调整细胞密度为4×104后，接种于6块96孔板(每孔200 μL)，置37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。细胞经48 h贴壁培养后，弃原培养液，按4种材料将细胞随机分为4大组，每一大组再随机分为100%、50%25%、12.5%浸提液组和阴性对照组、阳性对照组共6组每组复5孔。各实验组分别加入相应材料不同体积分数的浸提液，阴性对照组加入DMEM培养液，阳性对照组加入体积分数为0.64%苯酚液，每孔200 μL。另设不接种细胞，仅加DMEM培养液的孔作为空白对照。置37℃，50 mL/L CO2培养箱中继续培养，分别在培养24、48、72 h各时间点，取出各组细胞，用倒置显微镜下观察细胞形态。然后每孔加入20 μL MTT(浓度为5 mL/L，溶于PBS中)，孵育4 h后吸除孔内液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，结晶充分溶解后在全自动酶联免疫检测仪上，以490nm波长测定各孔吸光度值(OD值)。按下列公式计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR):设阴性对照组的 RGR为100%，细胞相对增殖率(RGR)=(实验组OD均值－空白对照OD均值)/(阴性组OD均值－空白对照OD均值)×100%。然后再根据RGR分为5级(表1)。

表1 细胞毒性评级标准

1.3 统计学分析

Excel建立数据库，采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 细胞来源鉴定

培养的人牙髓细胞呈典型的成纤维细胞的形态，呈长梭形或不规则三角形，细胞边界清楚，表面有突起，胞质丰满且透明，胞核椭圆形或圆形，核仁清晰，细胞排列呈片状、束状或漩涡状。抗波形丝蛋白染色阳性(图1)，抗角蛋白染色阴性(图2)，说明细胞来源于中胚层。

图1 人牙髓成纤维细胞抗波形丝蛋白阳性(SP×40)

图2 人牙髓成纤维细胞抗角蛋白阴性(SP×40)

2.2 细胞形态学观察

倒置相差显微镜下观察，人牙髓成纤维细胞在4种牙本质粘结剂浸提液的作用下，形态均发生不同程度的变化。细胞接种24 h后，各孔细胞贴壁，铺满孔底70% ～80%，密度均匀，形态正常，细胞折光性强，呈长梭形或不规则三角形。加样24 h后，阴性对照组细胞形态正常，阳性对照组细胞大部分死亡。各实验组部分细胞出现变圆的现象。MTT染色，阴性对照组可见大量蓝紫色结晶，阳性对照组仅见少量结晶。随着培养时间的延长，阴性对照组细胞数量增多，细胞形态正常;阳性对照组细胞大面积死亡，视野内可见细胞死亡后残存的碎片，剩余的少数细胞，可见明显的形态异常;各实验组细胞伪足明显回缩，细胞间距加大，密度降低。MTT染色，阴性对照组蓝紫色结晶密布孔底，阳性对照组结晶稀少，各实验组均出现不同程度的蓝紫色结晶，结晶减少。

2.3 4种牙本质粘结剂不同体积分数浸提液作用不同时间影响牙髓成纤维细胞增殖的比较(OD值)

4种材料不同体积分数浸提液分别作用于人牙髓成纤维细胞，在24 h时后，12.5%浸提液时，4种材料之间相比差异均无统计学意义(P＞0.05);25%浸提液时，材料2的OD值最低，与其他3种材料相比均有显著差异(P＜0.05);50%浸提液时，材料2与其他3种材料相比均有显著差异(P＜0.05);100%浸提液时，材料4与材料1、材料3相比有显著差异(P＜0.05)，材料2与其他3种材料相比无显著差异(P＞0.05)(表2)。

表2 不同体积分数浸提液作用24 h各组OD值比较()

表2 不同体积分数浸提液作用24 h各组OD值比较()

*与材料1比较P＜0.05;#与材料2比较P＜0.05;△与材料3比较P＜0.05;☆与材料4比较P＜0.05。括号内数字为毒性级

体积分数(%) 材料1 材料2 材料3 材料4阴性 100.00 ±0.00(0) 100.00 ±0.00(0) 100.00 ±0.00(0) 100.00 ±0.00(0)12.5 116.81 ±8.68(0) 102.48 ±18.29(0) 113.51 ±16.73(0) 102.25 ±14.95(0)25 127.27 ±22.16#(0) 99.57 ±17.02* △☆(1)128.03 ±14.33#(0) 118.54 ±15.19#(0)50 114.57 ±15.94#☆(0) 90.40 ±21.35* △☆(1)117.66 ±11.28#(0) 132.00 ±14.64*#(0)100 80.20 ±13.11☆(1) 87.04 ±22.95(1) 82.85 ±11.47☆(1) 99.15 ±15.32＊△(1)阳性 3.09 ±0.32(4) 4.31 ±0.79(4) 3.09 ±0.54(4) 4.03 ±2.15(4)

在48 h后，12.5%浸提液时，4种材料之间相比无显著差异(P＞0.05);25%浸提液时，材料2与材料3、材料4相比差异显著(P＜0.05)，材料1与其他3种材料相比无显著差异(P＞0.05);50%浸提液时，材料4与材料1、材料2相比均有显著差异(P＜0.05)，材料3与其他3种材料相比无显著差异(P＞0.05);100%浸提液时，材料1与材料4相比有显著差异(P＜0.05)，材料2、材料3与其他材料相比无显著差异(P＞0.05)(表3)。

在72 h后，各组之间相比差异均无统计学意义(P ＞0.05)(表4)。

表3 不同体积分数浸提液作用48 h各组OD值比较()

表3 不同体积分数浸提液作用48 h各组OD值比较()

*与材料1比较 P＜0.05;#与材料2比较P＜0.05;△与材料3比较P＜0.05;☆与材料4比较P＜0.05。括号内数字为毒性级

?

表4 不同体积分数浸提液作用72 h各组OD值比较()

表4 不同体积分数浸提液作用72 h各组OD值比较()

括号内数字为毒性级

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2.4 4种材料同一时间不同体积分数浸提液作用下细胞相对增殖率比较(图3～6)

图3 G－Bond同一时间不同体积分数浸提液的细胞相对增殖率

图4 i－Bond同一时间不同体积分数浸提液的细胞相对增殖率

图5 Clearfil S3Bond同一时间不同体积分数浸提液的细胞相对增殖率

图6 xeno V同一时间不同体积分数浸提液的细胞相对增殖率

3 讨论

口腔是一个直接与外界相通的腔隙器官，局部用药方便有效且全身副作用小。给药途径多样，包括经釉质、牙本质、牙髓、根管、牙周组织、牙创面、牙龈内或骨膜下和口腔黏膜等途径［4］。同时，口腔疾病的治疗常涉及形态功能的恢复，如龋损修复、根管充填和义齿修复等，多种材料和器械等通过植入或非植入的方式应用于口腔疾病。因此，广义的口腔局部用药包括药品材料和器械的使用，对其安全性评价是临床目前研究所必需的内容。口腔局部用药的特点决定了细胞毒性实验具有更显著的地位［5］。

对于牙本质粘结剂，一般认为是通过粘结树脂聚合后残余物质(如游离单体、聚合中间产物和材料中的各种助剂)的溶出产生对人体的危害。体外研究表明，从粘结树脂中释放的单体成分与牙本质小管的紧密接触，有可能引发不可逆的生物学反应，其中含有的单体成分如 HEMA、BPA、TEGDMA、GMA，树脂基质类成分 Bis－GMA、UDMA 等均可对成纤维细胞系产生毒性［6］。

本研究中发现:在4种牙本质粘结剂浸提液的作用下人牙髓成纤维细胞形态均发生不同程度的改变:细胞伪足明显回缩，细胞间距加大，密度降低。说明4种牙本质粘结剂直接与牙髓细胞接触时均可对其产生一定的毒性作用。

4种牙本质粘结剂12.5%浸提液作用人牙髓成纤维细胞24、48、72 h后，细胞相对增殖率无明显差异，可能是由于在低浓度时粘结剂释放的单体种类少，量小。加样24、48 h后，i－Bond对细胞毒性的影响较其余3种粘结剂较大，xeno V对细胞毒性的影响较小，可能与粘结剂释放的单体类成分和量不同有关。G－Bond与Clearfil S3Bond细胞相对增殖率无差异，可能由于两者释放的单体成分相似;加样72 h后，4种牙本质粘结剂细胞相对增殖率无明显差异，可能是由于随着作用时间的延长，释放的单体质和量渐趋一致有关。

本研究采用各种牙本质粘结剂12.5%、25%、50%和100%4种体积分数浸提液进行MTT实验，可比较全面地评价各种牙本质粘结剂的细胞毒性，以便检测细胞毒性是否与材料溶出物有关、溶出物浓度与细胞毒性的剂量依赖关系。结果显示:G－Bond、Clearfil S3Bond、xeno V 3 种牙本质粘结剂作用人牙髓成纤维细胞24、48 h后细胞相对增殖率与浓度之间呈现类似“Hormesis效应”现象，即低浓度浸提液促进细胞增殖，高浓度浸提液抑制细胞增殖［7］;i－Bond呈现随浸提液浓度增加细胞相对增殖率降低的趋势，可能是与粘结剂溶出物及溶出物浓度与细胞毒性的剂量依赖关系不同有关。G－Bond与Clearfil S3Bond细胞相对增殖率呈现相同的浓度趋势，可能是由于释放的单体类成分和量相似。

随4种牙本质粘结剂浸提液体积分数的增加以及作用时间延长 ，各浓度组间细胞相对增殖率存在差异，作用时间上也有变化，人牙髓成纤维细胞在同一浓度浸提液作用下，随时间延长，细胞相对增殖率逐渐降低，这可能与粘结剂释放的单体种类和剂量有关，具体机制还需要进一步研究。

本研究采用组织块法体外培养人牙髓成纤维细胞，主要原因考虑用原代细胞培养的方法能更好地模拟人体内牙髓细胞的反应情况。细胞毒性实验与口腔实际情况有一定差别，由于实验条件的限制，无法将牙本质渗透性、牙髓腔内压力以及小管液的流动等因素考虑进去，而且每种材料的成分复杂，每种成分的扩散和吸附能力也不同［8］。因此，体外细胞毒性实验只是检测材料生物相容性的一个方面，并且在控制参数以下，封闭能力才是最重要的，因为具有一定细胞毒性的牙本质粘结系统并不是造成牙髓强烈炎症反应的主要原因，还必须配合体内或动物实验才能更全面地评价各种粘结剂与牙髓组织的生物相容性。

［1］王光华，彭式韫.牙体修复学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2007:205.

［2］Douglas WH.Clinical status of dentin bonding agents［J］.J Dent，1989，17(5):209 －215.

［3］Dumsha TC，Sydiski RJ.Cytotoxicity testing of a dentin system［J］.Oral Surg，1985，59(6):637 －641.

［4］史宗道，王晓娟.口腔临床药物学［M］.北京:人民卫生出版社，2000:3.

［5］郑宝敏，孙艳.放射性龋齿相关因素研究［J］.国外医学临床放射学分册 ，2006，29(4):196－202.

［6］张帼，黄翠，张智星，等.牙本质粘结剂对人牙髓细胞毒性的体外研究［J］.实用口腔医学杂志，2005，21(6):811.

［7］刘秀英，胡怡秀.毒理学默认量效关系模型的重新审视［J］.国外医学卫生学分册，2008，35(5):257.

［8］Ratanasathien S，Wataha JC，Hanks CT，et al.Cytotoxic interactive effects of dentin bonding components on mouse fibroblasts［J］.J Dent Res，1995，74(9):1602 －1606.