生长因子与牙周组织再生

安 莹 综述;陈发明，金 岩 审校

(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)

牙周疾病是以牙周支持组织破坏为特征的慢性感染性疾病，其造成的牙周附着丧失和牙槽骨缺损是临床急需解决的一个重要问题。牙周病治疗的最终目的不仅在于消除致病因素，终止疾病的发展，更重要的是使被病变破坏的牙周组织恢复原有的结构和功能，即获得牙槽骨、牙周膜和牙骨质的再生，并形成牙周新附着(new attachment)。牙周组织再生是一个需要多种细胞参与、信号分子调控的过程。虽然口腔组织工程的研究已取得重要进展，但在牙和牙周组织再生研究中，仍面临着巨大的困难和挑战。

生长因子是一类生物活性因子，其通过与靶细胞上的相应受体结合，调节细胞生长、伤口愈合和组织再生的有关基因而影响不同类型细胞的增殖、分化、趋化、移行、代谢、免疫应答、物质合成等，在牙周组织再生中发挥重要作用。目前发现的与牙周组织再生密切相关的生长因子主要有血小板源性生长因子(PDGF)、骨诱导形成蛋白(BMPs)、生长分化因子-5(GDF-5)、釉基质蛋白(EMPs)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、富血小板血浆(PRP)、胰岛素样生长因子(IGF)和转化生长因子(TGF-β)等。本文就上述生长因子的作用及其临床应用、控释技术和方法作一综述。

1 生长因子的种类和功效

1.1 血小板源性生长因子

血小板源性生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)是一种存在于血小板颗粒中的阳性粒子多肽，能够诱导成纤维细胞增殖、肉芽组织形成、胶原沉积以及再上皮化，具有很强的诱导牙槽骨和牙骨质再生的能力，在牙周组织再生中起着重要作用［1］。Chang等［2］在牙槽骨缺损的小鼠体内，通过手术植入含有PDGF-B的胶原基质或重组人的PDGF-B蛋白质，结果发现，小鼠体内牙槽骨的再生修复明显优于不含PDGF-B组，而且PDGF-B的剂量越多，效果越明显。Taba等［3］使用间接或直接的PDGF传递方式，通过含有促进或抑制生长的分子载体的基因治疗，可使牙骨质再生。Wang等［4］在试图证实PDGF应用于根面有促进组织再生作用的实验中发现，PDGF可以增强成纤维细胞的增殖，并认为，虽然PDGF在早期牙周组织再生中可以促进成纤维细胞的增殖，但无论是单独使用抑或与ePTFE膜同时使用，其作用机制仍有待进一步研究。另外有学者还在PDGF的基因治疗方面进行了尝试，并取得了一定的进展［5］。

1.2 骨诱导形成蛋白

骨诱导形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是 Urist(1965)［6］通过将脱钙的骨基质种植于动物的肌肉组织中发现的。BMP可促进牙周膜细胞(PDLCs)的增殖和DNA合成，升高PDLCs的碱性磷酸酶活性，能诱导牙周组织中未分化间充质细胞分化为成牙骨质细胞和成骨细胞［7］。Jin等［8］利用基因转染技术获得稳定表达且具有BMP生物活性的种子细胞，并将此细胞在体外与明胶复合后修复鼠牙槽骨人工缺损取得了成功。通过大量实验证实:单纯植入BMP液能提高组织成骨作用，且操作简单易于掌握，但无论是全身或局部应用都易于在体内扩散稀释或被蛋白酶降解，而且难以在新骨形成全过程中充分发挥其诱导成骨的作用，对大面积的骨缺损没有塑形功能，所以其修复效果远不如植入自体骨［9］。生长分化因子 -5(GDF-5)是骨诱导形成蛋白家族中较新的成员，将rhGDF-5·β-TCP和rhPDGF·β-TCP分别用于狗的人工骨缺损处进行比较，结果发现，rhGDF-5·β-TCP组骨再生的面积和高度均高于rhPDGF·β-TCP组，提示 rhGDF-5·β-TCP具有一定的促进牙槽骨再生和牙周组织愈合的作用，在牙周病治疗中有很大的潜力［10］。

1.3 釉基质蛋白

釉基质蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)是一组赫特威上皮根鞘分泌的基质蛋白，主要位于胚胎发育时期的釉质中。研究发现，hPDLCs在正常培养条件下可以低水平表达骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)，本身即具有成骨样表型［11-13］，而在 EMPs作用下，hPDLCs中OPN、BSP的表达量增高，并在牙根表面聚集［14］，诱导产生出生理性的无细胞牙骨质。以上结果提示，EMPs可以促进hPDLCs向成骨方向分化，从而使牙周硬组织再生。此外，马志伟等［15］报道，与细胞的粘附不同，EMPs可能通过一些功能位点促进hPDLCs迅速伸展，进入功能状态，从而促进牙周组织再生的能力。

1.4 碱性成纤维细胞生长因子

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)属于肝素结合生长因子家族，是一种阳离子多肽，具有促进细胞增殖生长及调节细胞代谢的功能，且没有种属特异性，可以对多种细胞起作用。Takayama等［16］研究证实，bFGF能在创伤修复的早期阶段促进牙周组织再生。Murakami等［17］认为bFGF可能是在创伤修复的早期促进未分化的牙周膜成纤维细胞(PDLFs)增殖，相应地增加其转化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞的数量，从而促进牙周组织再生。郑磊等［18］研究表明，bFGF对成骨细胞粘附特性的影响又与浓度有关，在0.1～10 ng/mL内促进成骨细胞在支架材料的粘附，10 ng/mL达到最大粘附率，但并非随浓度的增加而无限增大粘附率，究其机理可能与低浓度bFGF更有效促进成骨细胞表达整合素有关。Shimabukuro等［19］通过小鼠在体研究发现，FGF-2可刺激细胞迁移和磷脂酰肌酶(PI3K)的磷酸化，而PI3K和透明质酸(HA)的移动路径与PDLCs密切相关，提示FGF-2可能是通过调节细胞的移动、增殖、调控细胞外基质等功能促进牙周组织的再生。

1.5 富血小板血浆

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是自体血通过离心分离浓缩的含少量血浆的血小板。Hisaeda等［20］将来源于牛的异种骨与自体PRP复合，用于13例牙周病病人的牙槽骨缺损处，以单纯植入异种骨作为对照组，结果显示，术后6个月，PRP复合异种骨组的龈沟变浅，牙龈附着水平升高，修复效果明显优于单纯植入异种骨修复。虽然PRP的作用在动物实验和临床试验中都得到了印证，但目前对PRP内所含的生长因子及其相关作用机制还不甚明了［20］。施六霞等［21］通过实验表明，不同浓度的PRP与PDLFs的增殖、迁移和分化有关，且在一定浓度范围内对细胞的增殖、迁移和分化效果均呈剂量依赖性，但更高的浓度促进效果未见明显增强，反而有减低的趋势;同时，其促进细胞增殖的效果还呈明显的时间依赖性。该实验结果更进一步证实了PRP有明显的促进牙周膜成纤维细胞功能的作用。

1.6 其他生长因子

除上述因子外，还有研究证明，骨基质中含量最多的胰岛素样生长因子(IGF)，可通过诱导细胞繁殖、分化和胶原蛋白的合成而促进骨的合成，从而促进牙周组织的修复再生。Cho［22］等报道，将IGF-I植入鼠磨牙牙周骨缺损后能明显促进牙骨质形成。另外，转化生长因子(TGF-β)在牙周组织再生修复上也有潜在的调节作用，牙周组织的免疫组化表明，细胞性牙骨质中大多成牙骨质细胞和成骨细胞内有大量TGF-β表达，而无细胞性牙骨质附近的成牙骨质细胞内则无TGF-β表达，根据细胞性牙骨质的代谢较活跃的特点，提示TGF-β可能与牙骨质和牙槽骨再生密切相关［23］。

2 生长因子的临床应用

2.1 临床应用情况

自20世纪80年代生长因子开始应用于临床至今，其对创伤修复的促进作用已逐渐得到确定。Oates和 Denniso等［24-25］在研究人 TGF-β 对人牙周膜细胞的作用时发现，TGF-β能促进细胞增殖，在0.1～20 μg/L范围内呈浓度依赖性，最佳浓度为10 μg/L，与PDGF联合应用时，二者有协同效应。Bergh等［26］在上颌窦提升术中分别应用重组人的BMP-7和自体骨移植进行比较，结果显示，应用rhBMP-7组在术后6个月可见血运良好的类骨样组织形成。Sigurdsson等［27］用 PTFE生物膜与BMP联合植入牙周缺损区，发现联合应用组比单用生长因子组达到了较好的愈合。Park等［28］对由PDGF-BB调控引导组织再生(P-GTR)治疗和GTR治疗进行比较，发现P-GTR对牙周组织修复和再生的效果更明显。此外，还有大量的随机对照试验都证明，PDGF能刺激骨的生成，对牙周附着的再生有重要的意义［29］。有研究报道，在猴子体内通过凝胶载体引入重组人血小板源性生长因子(rhPDGF)和胰岛素样生长因子(rhIGF)，4周后，通过组织学可观察到牙骨质、牙周膜、牙槽骨、牙周新附着的生成［30］。Howell等［31］通过对 38 例病人的临床试验研究发现，rhPDGF-BB和rhIGF-I也可以促使人体内牙槽骨再生。BMP-7又称成骨蛋白(OP-1)，有研究证实其对骨的生成和细胞分化具有调节作用［32］。有人在临床试验中，通过对患有牙周炎的妇女在牙周手术中应用0.3%的FGF-2，经过 3年的观察，牙槽骨的再生达到69.14%，X线片显示骨组织再生达到3 mm。由此得出结论，FGF-2能刺激牙周炎病人的牙周组织再生［33］。

研究证明，EGF主要作用于上皮细胞，而FGF对肉芽组织生长的促进作用更强，PDGF则对间充质细胞、胶质细胞增殖具有显著的调节作用［34］。Nakahara等［35］报道可用胶原作为支架，携带bFGF明胶微球修复犬的人工牙槽骨缺损;Holland等［36］则成功的将bFGF的缓释延长到3～4周。如能将这些研究成果应用于牙周组织再生技术的研究，必将给GTR的治疗效果带来质的飞跃。

2.2 存在的困难和挑战

尽管关于生长因子与牙周组织再生的报道很多，但其中还存在一些困难有待解决。目前临床应用最多的是将生长因子与材料复合，但是这种应用还达不到真正缓释的目的，达不到临床所需要的治疗效果。况且牙周组织再生时所应用的生长因子大多只有一种或两种，而牙周组织的再生修复则是一个复杂的过程，受多种因素的影响，需在多种因子联合调控下完成。因此，还需就生长因子间如何协同作用、生长因子的合适选择、如何配伍和选用多大剂量等方面进行深入的研究［37-38］。最近，有关药物控释方面的研究很多，并取得了一定的成果，所以，药物控释技术将会对上面所提到的困难带来新的突破。

3 生长因子控释技术

3.1 研究现状

近年来，药物控释系统的研究得到突飞猛进的发展，并取得可靠的临床疗效，同时也制备了许多具有靶向性、药物释放可控性、药理学稳定且易于药物释放的可降解的缓慢释放体系［39］。药物载体形式上实现了从传统载体到微载体、纳米载体的发展，性质上正经历着缓释给药到控释给药、智能给药的突破，开辟了药物制剂领域一个全新的时代。将智能给药的经验引入活性生长因子的控制释放，制备生长因子控释系统，成为外源性生长因子开发和利用的有力手段，必将为牙周组织再生研究带来一个全新的时代［40］。现在的研究表明，生长因子与许多骨支架材料复合后都可以达到一定的缓释效果。

控释系统(controlled release system)是现代药剂学中发展最快的一类新型给药系统，采用缓控释制备技术延缓和控制药物的释放速度，以提高疗效，降低不良反应，延长给药间隔以及提高病人服药的顺应性。生长因子控释系统必须同时满足以下条件:组织相容性好，降解产物无毒;可制成不同形式的载体，并且制作工艺简单;有足够大的载药量;能持久保存生长因子的生物学活性［40］。这时，生长因子才能与周围组织均匀接触，利于诱导周围细胞的增殖分化、可作为骨生长支架促进骨生长三重作用。

越来越多的研究表明，借助生长因子缓释系统实现活性药物的缓慢释放，将是解决问题的关键之处。国内外有大量学者在进行这方面的研究，并有一些报道。但目前大多数研究还处在初级阶段，还有许多问题没有解决，主要表现在:①“突释效应”造成释药早期药物大量释放的问题;②制备控释系统的载体材料问题还没有真正解决;③持久保持生长因子生物活性的问题;④生长因子的控释虽然取得了一定的进步，但离临床需要还有较大的距离。要想达到生长因子真正缓释的目的，就一定要适应组织再生的需要，实现生长因子定量、持续、高效释放，持续促进组织再生。由此可见，实现生长因子的控制释放，必须借助控释给药技术和载体材料上的创新和发展［36］。

3.2 常用控释方法

3.2.1 生物陶瓷材料

生物陶瓷是指用作特定的生物或生理功能的一类陶瓷材料，即直接用于人体或与人体直接相关的生物陶瓷材料。该材料具有良好的生物相容性和骨传导性，能与细胞等生物组织表现出良好的亲和性，可作为生物硬组织的代用材料用于牙周组织的再生方面。主要包括:β-磷酸三钙(β-TCP)、磷酸钙人工骨(CPC)、透明质酸(HA)等［41］。有研究表明，将β-TCP作为rhGDF的载体植入狗的人工牙周缺损部位，能明显促进骨和牙周组织的再生［10］。目前广泛应用于临床的多孔磷酸钙人工骨(porous calcium phosphate cement，PCPC)，具有良好的生物相容性［42］，能与自体骨紧密连接，且随时间推移逐步降解。将PCPC与一定比例的BMP-2·bFGF复合，异位植入裸鼠皮下，8周后组织学观察可见有大量的骨组织生成［43］。将体外培养的人牙周膜细胞接种到碳化二亚胺交联的胶原、透明质酸、透明质酸·胶原支架上，用MTT法检测支架对人牙周膜细胞黏附、生长的影响，结果表明:透明质酸/胶原支架更有利于人牙周膜细胞的黏附，提示该材料具备成为牙周组织工程理想支架材料的潜力。

3.2.2 微球

微凝胶(microgel)是在良性溶剂环境中交联的一种聚合物粒子，粒径可在1 nm～1 mm间调控，是近几年正在研究的一类新型药物载体。微凝胶具有微海绵一样的特性，可以使溶剂分子和小分子药物进入其孔状结构的空隙而发生溶胀，而且微小的环境变化(如温度、pH值、电场等)即均能引起微凝胶可逆性的溶胀和收缩，其体积变化可达几百倍以上［44］。目前，制备微凝胶的材料多用天然多糖生物材料如右旋糖酐，该材料具有无毒、抗菌、生物降解等特点，在医学上特别是作为注射、口服生物药物的载体材料得到较为广泛的应用，证实了其良好的生物相容性，可以解决目前药物载体材料的组织相容性问题［45］。右旋糖酐基微凝胶作为蛋白药物、脂质体载体已经有大量的研究经验，制备方法包括结晶化、物理交联、化学交联、辐射交联共聚合等等，制备工艺简单，可以制备不同粒径的微球或者微囊，载药量大、包封率高，反应条件温和，可以避免蛋白类药物的变性、失活，克服了传统生物材料的局限性［45］。改性后的右旋糖酐基微凝胶载体材料是一种智能材料，可以赋予其温度敏感、pH敏感特性，对周围环境变化具有“感知”能力，具有智能给药材料的基础，有望达到控释给药的目的［46-47］。在动物模型中，微球载体可控制性的释放生长因子IGF-1，对牙周组织的再生起到很关键的作用［48］。

3.2.3 支架

牙周组织工程中多使用体外基因治疗的方法，将基因在体外转染特定细胞，再植入体内培养，因此支架材料在牙周组织工程中起到重要作用。近年来，各种支架材料的发展，使得牙周组织再生中相关细胞和分子的培养得以成功进行。β-TCP是FGF-2最合适的支架载体，两者的联合应用将会提高牙槽骨和牙骨质的再生［49］。HA-壳聚糖支架对bFGF有很好的控释效果，而且这种控释作用可持续长达168 h［50］。但理想的支架载体也不是随处可得的，它还必需具备以下条件:①有良好的生物相容性和生物降解性，不影响生长因子功能的发挥;②无免疫原性或低免疫原性;③具有骨传导性或骨诱导性;④有一定的机械耐受性，可对抗外力，并在骨缺损区起支架作用;⑤具有良好的三维结构和高孔隙率，有利于各种生长因子的复合和黏附［51］。

3.2.4 复合体

近年，以微球与支架的复合体作为载体也逐渐被应用于临床。陈发明等［52］将支架和微球支架的复合体分别对BMP生长因子的控释效果进行比较，结果显示，复合体支架上可见大量的PDLCs附着。通过对附着在支架上的PDLCs的磷酸酶活性、骨蛋白含量、骨钙沉积量的测定结果进行分析发现，复合体支架上的PDLCs的成骨分化能力明显高于单纯的支架载体，提示以微球和支架的复合体作为载体控释BMP，应用于牙周治疗将会增加牙周组织的再生。另外，还有研究证明，通过一种新型热敏的、生物可降解的Dex-GMA·水凝胶微球支架复合体控释BMP，将会给自主给药带来新的希望，在组织再生工程的应用也将成为可能［53］。

4 前景和展望

4.1 新型载体

随着新型超声微泡造影剂的研究和应用，超声微泡不仅能增强超声造影，而且也能作为运送基因或药物的载体。在超声作用下，含基因或药物的微泡能穿透血管内皮，释放基因或药物，达到靶向治疗目的［54］。张云燕等［55］将体外培养的 hPDLFs，以EGFP基因为报告基因，脂质微泡造影剂为载体，用超声辐照介导质粒EGFP-N1转染hPDLFs，结果显示，超声微泡介导的基因转染在适宜转染条件下能提高基因转染效率，对hPDLFs活性影响小，有望成为治疗牙周炎的一种安全、有效的基因转染方法。仲林等［56］成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达载体，通过超声微泡转基因技术成功转染入hPDLFs并得到有效表达，为进一步研究该质粒与超声微泡转基因技术在牙周再生基因治疗中的应用提供实验基础。

固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLDs)是近年来很受重视的一种新型药物传递载体，它综合了传统胶体给药系统如乳剂、脂质体、聚合物纳米粒等优点，具有靶向、控释、提高药物稳定性、毒性小、可大批量生产等特性，可供多途径给药［57］。在临床上已经得到证实，SLDs可以促进口服药的生物学利用度［58］。Pandey 等［59］将合并多种抗结核药物的SLDs制备成乳液溶剂，通过在老鼠体内实验得出，以SLDs为基础的抗结核治疗，将大大提高了治疗效果。但是还未发现在牙周的临床应用，需要再进一步的研究。

4.2 商业化载体

随着生物活性分子在牙周组织再生方面的研究进展，其商业吸引力也与日俱增。现已有的商业化载体有:纤维蛋白胶(Fibrin glue or fibrin sealant)、Emdogain® 、GEM 21S® 、INFUSE® 、成骨蛋白 -1(OP-1)等。纤维蛋白在组织创伤愈合和组织再生治疗的应用来源于生理性纤维蛋白凝集块，是正常组织修复的一种重要的临时性基质。纤维蛋白、GFs或其他生物材料的联合应用，加强了复合基质的生物学活性或提高了复合基质的生物机械性能，对组织的再生有很好的疗效。然而，在牙周和骨再生的实验研究发面未见报道［60］。EMD是一种不成熟釉基质的提取物，可以诱导间充质细胞分化为牙周组织细胞，调节牙根的发育和刺激牙周组织再生［61-62］。一种商业化的 EMD(Emdogain® ，Biora AB，Malm®，weden)已被美国FDA认证，并应用于牙周的治疗，其临床效果比翻瓣术和GTR技术还要好［63］。GEM 21S®是通过使用创新性的组织工程原理，即联合生物活性蛋白(高纯化的rhPDGF-BB)和骨诱导基质(β-TCP)形成的一种应用于临床的基质。生物因子增强基质(GEM)含有人体主要的生长因子PDGF和骨诱导基质，PDGF是通过募集和刺激周围基质中的细胞来发挥作用的，提高骨和牙骨质的再生能力［29］。美国以 INFUSE® (Medtronic，Minneapolis，MN，USA) 和欧洲以InductOSTM(Wyeth，Maidenhead，UK)命名的产品，这些产品的主要成分是rhBMP-2及其运输载体胶原海绵(ACS)。尽管INFUSE®在骨折的治疗中有很大的作用［64-65］，但是仍缺少其在牙周组织重建的临床研究，还需要进一步的基础科学研究和大量的临床试验［66］。

5 结论

生长因子与载体的联合应用逐渐应用于临床，对牙周组织的再生起到了很重要的作用，但研究还处于初级阶段，还有许多问题亟待解决。深入进行控释技术和控释方法的研究，构建理想的支架微球材料-生长因子复合体，选择合适的生长因子组合和研制新型载体-控释系统将是牙周组织再生的研究方向。随着商业化载体的不断问世，相信生长因子将会给牙周组织的再生修复带来良好的效果。

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