不同材料诱导犬根尖形成的比较研究

黄锐 刘鹏 肖茂德等

[摘要] 目的 比较羟磷灰石（HA）、氢氧化钙（CH）、Vitapex诱导犬年轻恒牙根尖形成的效果。方法 选用2只5～6月龄犬的16颗恒切牙，去髓后随机分为4组。A、B、C组为实验组，依次用HA、CH及Vitapex糊剂充填根管；D组为对照组，用AH plus糊剂充填。采用锥形束CT（CBCT）测量牙根长度及根尖面积的变化；制作石蜡切片行苏木精-伊红（HE）染色，观察根尖组织形态；制作冰冻切片行碱性磷酸酶（ALP）染色，观察细胞的成骨活性。结果 1）CBCT结果显示：术后4周，各组牙根均较术前延长（P<0.05），3个实验组的根尖面积较术前缩小（P<0.05）；术后8周，各组根尖均显示高密度闭合影像。2）组织切片显示：各组根尖均无炎症反应；术后4周，根尖均未闭合，但有牙骨质及牙周膜伸入根管；术后8周，A组根尖被完整的牙骨质屏障封闭，ALP阳性细胞分布集中，B、C组牙骨质屏障内有间隙，牙周膜伸入其中，ALP阳性细胞散在分布，D组根尖仍有稀疏牙骨质和类牙骨质沉积，并有纤维及血管组织增生，ALP阳性细胞不明显。结论 经去髓后的年轻恒牙在无感染时牙根能继续发育，牙周膜可能是其发育的组织来源；HA诱导根尖形成的速度较快，是一种理想的根尖诱导材料。

[关键词] 根尖诱导； 锥形束CT； 羟磷灰石； 碱性磷酸酶； 牙周膜

[中图分类号] R 781.34 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.012

年轻恒牙的牙根在牙髓感染或根尖感染后可停止发育。根尖诱导成形术是在消除感染的基础上，用药物诱导根尖周硬组织形成并使牙根继续发育的方法[1]，而寻找理想的诱导药物则是人们一直研究

的课题。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是牙齿、骨等硬组织形成、再生的重要矿化酶，其活性强弱反应了组织的成骨能力[2]，而冰冻切片ALP染色是观察组织中ALP活性的经典方法。本研究拟通过锥形束CT（cone beam CT，CBCT）影像学观察、组织形态学及酶组织化学等方法对比几种常见根尖诱导剂诱导犬根尖形成的效果，探讨牙根继续发育的可能机制，为临床根尖诱导成形术中选用有效的药物提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要设备及材料

KaVo 3D-eXam型CBCT；纳米级羟磷灰石（hy-droxyapatite，HA）粉剂（AMRESCO公司，美国），甘油（分析纯，郑州化工试剂二厂），氢氧化钙（calcium

hydroxide，CH）糊剂（含散剂和液剂，湖北泰辰健瑞药业有限公司），Vitapex糊剂（日本森田株式会社），AH plus糊剂（Densply公司，美国）等。

1.2 实验动物

5～6月龄健康杂种犬2只（由重庆医科大学动物

实验中心提供），分别命名为甲、乙犬，雌雄各1只，体重分别为6.8、7.2 kg。

1.3 实验方法

1.3.1 实验用糊剂的制备 HA：纳米级HA粉剂和甘油按等体积比混合调成糊状；CH、Vitapex、AH plus糊剂等按厂家说明使用。

1.3.2 实验动物的处理 1）术前观察：甲、乙犬分别拍摄CBCT片，证实两只犬共16颗恒切牙根尖均未发育完全，测量牙根长度及根尖面积。2）根管预备及充填：用速眠新Ⅱ按0.1 mL·kg-1肌注麻醉动物，质量分数0.1%氯己定冲洗口腔，将16颗恒切牙进行根管预备，然后随机分成A、B、C、D共4组，分别充填HA、CH、Vitapex、AH plus，最后用玻璃离子水门汀充填。3）甲犬的术后处理：术后4周拍摄CBCT片，测量牙根长度及根尖面积，随即麻醉下处死，取实验区域牙及颌骨，经4 ℃固定、脱钙、脱水、包埋后以根尖孔为中心制作石蜡连续切片，行苏木精-伊红（hematine-eosin，HE）染色。4）乙犬的术后处

理：分别于术后4、8周拍摄CBCT片，测量术后4周牙根的长度及根尖面积；术后8周处死动物，4个标本按甲犬的处理方法制片行HE染色，另外4个标本按杜卓民法[3]制作冰冻切片行ALP染色。

1.4 观察方法及内容

1.4.1 CBCT影像学观察 采用扫描的原始数据进行三维重建，获得实验牙区域多层面的轴位、矢状位及冠状位图像。以右上颌中切牙为例（图1），分别调

节其轴位、矢状位及冠状位的x、y坐标轴，其交点O为根尖位置，从矢状位测量牙根长度，并在根尖处沿与牙根长轴垂直的方向做切面，获得根尖部位的横断面形态，利用软件中的亨氏单位（hounsfield unit，HU）统计功能，从横断面测量根尖面积。

1.4.2 组织学观察 各组的HE染色样本用于观察根尖大体形态及根尖区细胞的组成及分布，ALP染色样本用于观察根尖周区域ALP阳性细胞（细胞呈黑色染色）的分布情况。所有样本均在普通光学显微镜下观察。

1.5 数据处理及统计学分析

所有数据重复测量3次，记录其平均值，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，统计方法采用单侧配对t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 CBCT观察结果

4组牙齿术前和术后4周的牙根长度和根尖面积见表1。术后4周，4组牙齿的根尖孔均未闭合（图2），

但牙根长度与术前相比，其变化均有统计学意义（P<

0.05）。A、B、C组根尖面积的变化与术前相比有统计学意义（P<0.05），而D组根尖面积的变化则无统计

学意义（P>0.05）。术后8周，因甲犬已处死，样本量

较小，测量数据未行统计学分析，但各组根尖横断面均显示有密度较高的闭合影像（图2），其中A组与B组、C组与D组的根尖几乎分别位于同一横断面上，为描述方便，将A组与B组、C组与D组根尖横断面影像分别合并描述。结果提示，AH plus组的根尖闭合速度慢于其余3组。

2.2 组织切片观察结果

4组牙齿的组织切片染色结果见图3～5。术后4周，各组根尖孔均未闭合，但有牙骨质及牙周膜伸入根管内，仅A、B、C组可见活跃的成骨细胞及新生骨组织。术后8周，A组根尖孔封闭，根管腔和牙周膜被牙骨质屏障隔绝，牙周膜中ALP阳性细胞呈带状集中分布；B、C组牙骨质屏障内有间隙，牙骨质边缘仍有成牙骨质细胞增生，牙周膜伸入其中，并有纤维及血管组织增生，ALP阳性细胞呈散在分布；D组根尖有稀疏的牙骨质、部分未矿化完全的类牙骨质沉积及纤维、血管组织增生，其间仍有成牙骨质细胞，ALP阳性细胞不明显。另外，各组均未见炎症细胞。根据组织切片观察结果，可以认为HA组根尖闭合速度最快，且与成骨相关的细胞分布较为集中。

3 讨论

近年来，有学者在牙周膜组织中鉴定出了干细胞，即牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC），具有分化为成牙骨质细胞，成骨细胞以及分泌骨、牙骨质、牙周膜样组织的能力，能发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用[4]。牙周膜干细

胞巢（periodontal ligament stem cell niche，PDLSCN）是PDLSC周围的微环境，由支持细胞、基质及生长因子等组成。生理情况下，PDLSCN中各种成分处于相对平衡稳定的状态，能很好地调控PDLSC的功能，但PDLSCN受到某种因素影响致使各种成分平衡打破或出现功能失调时，则会严重影响PDLSC的分化功能[5]。

从本实验组织切片可观察到，根尖区牙周膜可向根管腔内迁移并逐渐形成牙骨质结构以封闭根尖，未完全封闭的根尖可见大量纤维，推测牙周膜中的PDLSC在某种调控下分化为成牙骨质细胞，进而形成牙骨质；同时，牙周膜中的纤维也能矿化形成类牙骨质结构而封闭根尖孔。4种材料诱导根尖孔闭合的速度以HA最快，AH plus最慢，造成这种差异可能是不同材料诱导硬组织形成的能力及对PDLSC向成牙骨质细胞分化的过程产生了不同的影响所致。

不同的材料为与之接触的各种细胞提供了不同的细胞外基质，从而提供了不同的刺激信号，引起细胞不同的黏附、生长及分化等功能，表现为细胞相容性的差异，对材料生物功能的发挥起到了重要作用[6]。

HA是牙齿的主要无机成分，是一种细胞相容性很好的材料，具有传导成骨特性[6]。卢晓风等[7]研究证实，成骨细胞能在HA/磷酸三钙（tricalcium phos-phate，TCP）支架上很好地贴附生长，并具有较强的ALP活性及形成矿化的细胞外基质等成骨表型。有学者[8]在纳米HA诱导人牙周膜细胞ALP表达的研究

中发现，纳米HA与致密HA相比，具有促进细胞在增殖早期向骨化亚群分化的作用。本研究中，HA组根尖形成最快，ALP阳性细胞分布集中，一方面是由于使用流动性较好的甘油作为溶剂，HA能在局部均匀扩散；另一方面，HA良好的细胞相容性能聚集更多的PDLSC及成骨相关细胞，其良好的传导成骨性也可使局部硬组织加快形成。

CH和Vitapex的作用机制相似，其诱导硬组织形成依赖局部Ca2+和OH-的浓度[9]，故其促进矿化的作

用受到其溶解度的限制；另外，有研究[10]表明，CH解离出的OH-可改变细胞器和酶，影响细胞分裂，这可能影响本研究中CH、Vitapex组PDLSCN中细胞的生理功能，从而影响其诱导根尖形成的效果。

AH plus糊剂为树脂类根管封闭剂的代表，可挥发甲醛而具有较弱的抗菌性和细胞毒性。有研究[11]发现，0.1%的AH plus能导致肝细胞表面损伤甚至细胞死亡。本实验中AH plus组根尖闭合速度最慢，可能因其细胞毒性破坏了PDLSCN对PDLSC的调节，从而延缓了该组根尖的闭合。

综上所述，在适当诱导条件下，牙周膜组织可分化形成牙骨质样结构封闭根尖，其效果可能主要与PDLSCN微环境密切相关，其中HA作为一种理想的新骨形成的生理基质能较好地促进根尖的继续发育，可为临床治疗提供参考。

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（本文编辑 吴爱华）