牙本质基质蛋白—1仿生多肽的设计与评价

刘巍 曹颖 沈军等

[摘要] 目的 设计一种牙本质基质蛋白-1（DMP-1）的仿生多肽，仿生DMP-1与胶原纤维结合，并启动矿化功能。

方法 依据DMP-1与胶原纤维结合的功能序列以及釉原蛋白介导羟磷灰石成核的功能序列，采用固相合成法合成DMP-1仿生多肽，其氨基酸序列为DSESSEEDRTKREEVD。利用免疫荧光法评价该多肽与胶原蛋白的结合能力；将其依次浸入氯化钙溶液和磷酸氢二钠溶液中，采用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）以及选区电子衍射环（SAD）分析其诱导羟磷灰石晶体成核生长的矿化能力。结果 免疫荧光结果表明：本研究设计的DMP-1仿生多肽可以与牙本质胶原纤维结合；SEM、TEM观察结果显示：该多肽可以从溶液中摄取钙磷离子，诱导羟磷灰石晶体成核矿化。结论 多肽DSESSEEDRTKREEVD可以模拟DMP-1与胶原蛋白结合及启动矿化的能力，可以作为研究牙本质仿生矿化的一种分子工具。

[关键词] 牙本质基质蛋白-1； 多肽； 仿生； 生物矿化

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.003

从微结构构成角度看，牙本质是由矿化的胶原纤维组成的多等级结构[1]。如何诱导牙本质病变区

脱矿的胶原纤维内矿化（intrafibrillar apatite），复制矿化胶原纤维的多等级结构，恢复牙本质结构的机械学性能，是目前的研究热点之一[2]，也是牙本质仿

生矿化的主要研究内容。生物矿化是有机基质模板调控下的无机晶体的成核生长与有机基质共组装的过程[1，3]。胶原蛋白是牙本质的基本结构蛋白，但是体外实验[2]表明，仅用单纯的牙本质胶原蛋白来启

动矿化成核，特别是实现胶原纤维内矿化是远远不够的，还需其他生物分子的参与。研究[2，4]发现，Ⅰ型胶原与牙本质非胶原蛋白的相互作用是牙本质矿物晶体形成的必要条件。牙本质非胶原蛋白主要包括牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）、骨涎蛋白、磷蛋白、骨桥蛋白等，它们富含天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸以及磷酸化的丝氨酸残基，其中-COOH、-PO4可以作为成核位点启动矿化。

DMP-1结合于牙本质胶原纤维的孔隙区域，可以促使晶体矿化颗粒沿胶原纤维长轴方向生长，在启动胶原纤维的矿化中起重要作用[5-9]。应用DMP-1

调控胶原纤维矿化是一种理想的途径，但是DMP-1提取困难且价格昂贵，易变性，因此寻求DMP-1的小分子仿生体具有重要的价值。自组装多肽的研制成功[10-13]，为牙本质仿生矿化提供了新的思路。在蛋白质分子层面，DMP-1的349DSESSEEDR357和424-SEENRDSDSQDSSR437是与胶原纤维结合的特定功能域结构[6]；而376ESNES380、386ESQES390、414-QESQSEQDS422、431DSQDS435是其诱导磷灰石成核矿化的功能域[8]。釉原蛋白是釉质发育中最重要的

蛋白质，其自组装的纳米微球超分子结构是调控磷灰石晶体组装成釉柱结构的分子基础。釉原蛋白分子C-端亲水的带电荷氨基酸尾巴“TKREEVD”位于釉原蛋白超分子结构的表面，与羟磷灰石（hydroxy-lapatite，HA）的成核矿化密切相关[14]。考虑到DMP-1与胶原纤维结合的序列424SEENRDSDSQDSSR437与诱导矿化成核的序列414QESQSEQDS422存在重叠现象，本研究拟以DMP-1与胶原蛋白结合的氨基酸序列349DSESSEEDR357以及釉原蛋白与HA成核有关的C-端亲水氨基酸序列TKREEVD为基础，构建一种新型的多肽分子，即DSESSEEDRTKREEVD，作为DMP-1的仿生体，评价其与胶原纤维的结合能力和诱导HA晶体成核的作用，为牙本质以及牙体组织的仿生矿化研究提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 DMP-1仿生多肽的设计与合成

采用固相合成法，通过肽键连接DSESSEEDR和TKREEVD两个寡肽片段，合成DMP-1仿生多肽的氨基酸序列，即DSESSEEDRTKREEVD；与此同时，采用相同的方法合成异硫氰酸荧光素（fluorescein iso-

thiocyanate，FITC）标记的相同序列多肽，即FITC-

DSESSEEDRTKREEVD，用于免疫荧光实验。

本研究所用多肽委托上海科肽生物有限公司合成，产品经高效液相色谱仪纯化以及质谱仪检验符合要求，其纯度为98%。

1.2 DMP-1仿生多肽与胶原纤维的结合能力

1.2.1 脱矿牙本质胶原纤维网片的制备 制备厚约0.5 mm的健康离体牙的牙本质片4片，置入500 mL 1%HCl溶液中，室温下磁力搅拌48 h以脱矿，然后漂洗，获得完全脱矿的牙本质胶原纤维网薄片。

1.2.2 脱矿效果评价 取2个脱矿牙本质胶原纤维网片行梯度脱水，临界点干燥仪（Quorum-Emitech K850型，Quorum公司，英国）行临界点干燥，扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）（S-4800

型，Hitachi Limited公司，日本）下观察表面形貌，通过X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）（XPert

PRO型，Philips公司，美国）确定晶体结构，评价是否完全脱矿。

1.2.3 免疫荧光实验测定多肽与胶原纤维的结合能力 将另外2个完全脱矿的牙本质胶原纤维网片做常规冰冻切片，制作约10 μm厚的脱矿牙本质切片，取4片切片浸入含1%（体积分数）的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）水溶液中孵育30 min（37 ℃），以阻挡非特异性吸附，然后吸出BSA溶液，将50 μL 0.5 g·L-1 FITC标记的多肽溶液（n=2，实验组）以及0.1 g·L-1的FITC标记的抗免疫球蛋白抗体（武汉市博斯特生物技术有限公司）（n=2，阴性对照组）分别滴加在牙本质片表面；样品在37 ℃环境下孵育30 min后，用PBS溶液漂洗（重复3次，每次5 min），然后置于荧光显微镜（DMI3000B Leica Microsystems型，CMS GmbH公司，德国）下，观察多肽与牙本质胶原纤维的结合情况。

1.3 DMP-1仿生多肽诱导HA晶体成核的能力

在透射电子显微镜（transmission electron micro-scopy，TEM）载物用镀膜铜网上滴加5 g·L-1的多肽溶

液40 μL后，再滴加2.5%戊二醛约10 μL以固定多肽，将滴加了多肽的铜网分别在10 mmol·L-1氯化钙溶液和5 mmol·L-1磷酸氢二钠溶液中各浸泡1 h（37 ℃），作

为1个循环，共进行5个循环完成交替矿化实验，以没有多肽涂层的铜网作为阴性对照；交替矿化后用蒸馏水漂洗，待铜网自然干燥，用SEM（FE-SEM，

Sirion 200型，FEI公司，美国）和TEM（TEMH-300型，Hitachi Limited公司，日本）观察沉积物的形态，以选区电子衍射环（selected area diffraction，SAD）确定晶体结构，分析DMP-1仿生多肽从溶液中摄取钙和磷酸根离子，及诱导HA晶体成核生长的能力。

2 结果

2.1 DMP-1仿生多肽与牙本质胶原纤维网的特异性

结合能力测定

SEM观察显示：牙本质片经HCl溶液处理后完全脱矿成为胶原纤维网（图1），未见HA晶体存在。经

XRD检查可进一步确定，脱矿的牙本质基质中无HA峰存在，仅在20°左右有胶原纤维宽峰（图2）。由此

可见，本实验设计的方法可实现牙本质完全脱矿。

A：× 2 000；B：× 80 000。

免疫荧光实验中，采用荧光蛋白标记的多肽分子，以荧光标记的免疫球蛋白抗体作为阴性对照，结果显示：DMP-1仿生多肽可以与牙本质胶原纤维结合，荧光显微镜下观察可见绿色荧光，呈阳性结果（图3A）；而对照组视野中鲜有免疫荧光，呈阴性

结果（图3B）。

2.2 DMP-1仿生多肽诱导HA晶体成核生长能力的

测定分析

本研究将DMP-1仿生多肽组装在TEM的铜网上，交替浸入氯化钙溶液和磷酸氢二钠溶液进行矿化诱导实验，这样可以直接观测到矿化结果。经过交替矿化处理后，通过TEM观察到有晶体形态的物质沉积在铜网上，排列有序并向一定方向延伸（图

4A），与对照组（图4B）有明显差别。观察TEM表征的同时对DMP-1仿生多肽组深色晶体区域提取电子衍射图，得到晶体电子衍射环图（图4A中的插图a），符合HA晶体的结构。通过SEM观察进一步证实，铜网表面均匀分布有片状晶体，多聚集成束（图5A）；

而没有多肽涂层的铜网，则观察不到晶体样结构（图4B、图5B）。

A：DMP-1仿生多肽与牙本质胶原纤维结合，可见绿色荧光；B：对照组抗免疫球蛋白抗体不能与胶原纤维结合，罕见绿色荧光。

A：DMP-1仿生多肽诱导HA晶体形成；a：晶体电子衍射环，图中数字表示特征环，符合HA晶体的特征；B：对照组无晶体形成。

A：DMP-1仿生多肽诱导HA晶体形成；B：对照组无晶体形成。

3 讨论

为了克服生物大分子，特别是蛋白质分子来源困难、存在变性特性等方面的不足，分子仿生学的重要目的之一就是设计小分子物质来替代生物大分子，复制生物大分子的功能。受生物系统自组装行为的启发，以及“bottom-up”纳米技术的发展，自组装短肽类生物材料作为一类新的生物材料越来越受到人们的关注[15]。许多自组装多肽，包括β-折叠离子多肽、肽两亲物已被用于细胞培养、组织再生，以及作为药物和基因的载体等方面。近年来自组装聚阴离子多肽也被用于仿生矿化的研究。Hartgerink等[10]开发出一种多肽两亲物，具有烷基尾巴，并含有一个离子多肽[C16H31OCCCCGGGS（PO4）RGD]，可以自组装形成纳米纤维，形成类似矿化胶原纤维样的结构。Kirkham等[11]开发了一种β-折叠自组装聚阴离子多肽（QQRFEWEFEQQ），用于釉质的再矿化和骨组织工程支架的构建。有学者[12-13]依据DMP-1、骨涎

蛋白与胶原结合的功能域以及与磷灰石结合的功能域，设计了一种非胶原蛋白模拟多肽——E8DS聚阴离子多肽（EEEEEEEEDSpESpSpEEDR），可以与Ⅰ型胶原结合并促进其仿生矿化。

多肽作为一类新型的生物材料在模拟生物大分子的功能方面已经显示出良好的应用前景。诱导脱矿的牙本质胶原纤维网再矿化是目前牙本质再矿化研究的热点之一。非胶原蛋白与胶原纤维的结合是启动胶原纤维矿化的分子基础。由于天然的非胶原蛋白含量较少，来源有限且价格昂贵，因此本研究设计了一种多肽类小分子来仿生非胶原蛋白与胶原纤维结合启动矿化，以期应用于胶原纤维的仿生矿化研究。作为启动胶原纤维矿化的非胶原蛋白的仿生体，必须满足两个先决条件：1）可以与胶原纤维结合，2）可以摄取钙磷离子诱导HA晶体的形成。本研究在设计多肽分子氨基酸序列时充分考虑了牙体组织矿化的特点，选取了DMP-1与胶原纤维结合的氨基酸序列DSESSEEDR及与HA成核有关的釉原蛋白分子C-端亲水的带电荷氨基酸尾巴TKREEVD，构建DMP-1仿生多肽。通过观察荧光标记的多肽分子，直接证明了多肽分子与脱矿的牙本质胶原纤维的结合能力；通过将载有多肽分子的TEM载物用铜网交替浸入含钙和磷酸根离子溶液中来观察多肽的诱导矿化作用，证明了DMP-1仿生多肽可从溶液中摄取钙、磷酸根离子诱导HA晶体形成。由此可见，本实验设计的多肽DSESSEEDRTKREEVD满足了作为非胶原蛋白DMP-1仿生体的先决条件，具有与胶原蛋白结合和启动矿化的能力，可以作为研究牙本质仿生矿化的分子工具；下一步将应用此多肽分子诱导脱矿的牙本质胶原纤维再矿化，修复病变牙本质的结构，恢复其机械性能。

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（本文采编 王晴）