干细胞治疗与牙周组织再生

杨 昊 综述，陈发明，金 岩 审校

(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)

牙周炎是由牙菌斑生物膜引起的牙周组织的慢性感染性疾病，是人类口腔健康的“头号杀手”，并与心血管疾病、糖尿病等全身疾病的发病密切相关。由牙周炎所导致的牙齿支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的破坏丧失是成年人牙齿缺失的主要原因。近年来，随着牙周植骨术和引导性组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)的广泛开展和临床应用，彻底改变了传统的牙周治疗观念，即牙周“修复”为牙周“再生”。但是，目前可供选择的手段和方法在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远远没有达到理想的目标。

组织工程学理论和技术的飞速发展为牙周组织再生提供了新的思路，生物活性因子、干细胞等新的生物学手段和方法也在牙周组织再生研究中被广泛应用。干细胞是一类未分化的，具有自我更新和多向分化潜能的细胞，是组织再生和重建的“基石”，随着细胞工程和组织工程技术的不断发展，干细胞治疗成为了多种组织器官修复再生的新希望。在再生牙科学领域，干细胞治疗也是牙周病治疗和牙周再生研究的热点，本文就干细胞治疗在牙周组织再生中的应用作一综述。

1 与牙周组织再生相关的干细胞

1.1 牙周膜干细胞

2004年，美国南加州大学牙学院颅颌面分子生物学研究中心施松涛教授指导的课题组首次发现了牙周膜干细胞(periodental ligament cells，PDLSCs)的存在［1］，此后相继研究证实了PDLSCs是一类维持牙周组织动态平衡和缺损修复的关键细胞［2］，在动物体内可以形成新的牙周组织结构［3］，为PDLSCs用于牙周组织再生治疗提供了依据。

1.1.1 PDLSCs的培养、分离和纯化

传统的牙周膜细胞的分离培养方法有酶消化法和组织块法。酶消化法是把已剪成小块的组织进一步松散，直接获得细胞进行培养的方法，此方法获得细胞数量多，但步骤繁琐，易污染，且需要组织量大［4］。组织块法是将拟培养的组织剪成小块直接接种于培养瓶的方法，此方法虽然因操作简单，需要组织量少而多被采用，但细胞贴壁率低，原代培养的成功率仅20%［5－6］，而将上述两种方法联合使用的酶消化组织块法则可使原代培养的成功率达到77.8%［7］。牙周膜细胞原代培养后，常用以下方法进行PDLSC的分离和纯化:①免疫磁珠法。分离PDLSCs所用的基质细胞抗原(stromal cell antigen，STRO－1)为间充质干细胞的表面标志物，基本步骤是将对数生长的牙周膜细胞与STRO－1抗体孵育使之与处理好的磁珠混合，然后放在磁力架上分离，用磁珠分离液分离磁珠后取上清液;②有限稀释法。将对数生长期的牙周膜细胞以1.0～1.5×104个/L的密度接种于96孔板，培养12 h后标记单个细胞孔，扩大培养，当克隆细胞长至孔底的1/3～1/2时胰酶消化传代;③流式细胞仪分离法。原理与免疫磁珠法相似，不同点是在分离前要对目的细胞进行免疫荧光染色;④神经微球形成培养系统。Techawattanawisal等［8］借鉴神经干细胞的特殊培养体系，将酶消化培养的牙周膜细胞放在含20 μg/L表皮生长因子、50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、10 μg/L 白血病抑制因子的无血清培养液中，成功地分离培养了大鼠的PDLSC。

利用免疫磁珠法和流式细胞仪法分离PDLSCs虽然简便易行，速度较快，但免疫磁珠法分离PDLSCs的获得率小于1%［9］，而且两者都需特殊器械，费用较高。而利用有限稀释法分离PDLSC虽较为繁琐，速度慢，但不需特殊器械，费用低，细胞克隆率为 2.3%［10］。

1.1.2 PDLSCs的鉴定

PDLSCs有多种细胞标志物，可利用这些标志物进行表型分析，以鉴定是否为PDLSC。其标志物主要分为以下几类:①间充质干细胞标志物，包括STRO－1和CD146/MUC18。STRO－1是用CD34阳性骨髓细胞进行免疫产生的小鼠IgM单抗，能识别人骨髓基质成分表达的表面抗原，是干细胞分化早期的标志物［11］，间接免疫磁珠法分离PDLSC主要用该抗体［1，9，12］。STRO － 1 不仅在 PDLSC 中有表达，在骨髓间充质干细胞中也有表达［1］;②腱细胞标志物。碱性螺旋环－螺旋转录因子是腱细胞特有的标志物，与骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞相比，PDLSC的该标志物表达水平更高，提示PDLSC是不同于骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞的新的间充质干细胞;③其他细胞标志物。PDLSC还可以表达包括 CD90、CD29、CD44、CD166、CD105和CD13在内的骨髓间充质干细胞的表面标志物［9－10］。此外，Kawanabe 等［13］通过荧光活体染料烟酸己可碱33342(Hoeehst33342)泵出实验，又从人的牙周膜中筛选了另一种源于造血干细胞的标志物——腺苷三磷酸结合盒转运体成员－2，从而丰富了PDLSC的研究，为PDLSC的分离鉴定提供了新的思路。除上述通过表型分析进行PDLSC鉴定外，还可根据PDLSCs在特定的培养环境下，可向成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞和胶原形成细胞［9］等多向分化的潜能，进行功能鉴定。

1.2 骨髓来源干细胞

骨髓基质细胞于20世纪60年代末由Friedenstein提出，实验中发现骨髓标本在培养过程中有呈贴壁生长的细胞群落，经几次传代后这些细胞仍能保持原代培养时的纺锤状，继续培养后能大量增殖，且能形成类似骨或软骨的沉积物。由此，Friedenstein将之称为骨髓多能基质干细胞，又名骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)［14］。此后的研究逐渐发现:BMSCs具有多向分化的潜能，可在不同的环境和细胞因子作用下分化为成骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞等［15－16］。Maniatopoulos 等［17］报道，用骨髓基质细胞在体外可培养出骨样钙化组织，经X线衍射分析其具有羟基磷灰石结构;Wakiiani等［18］利用兔骨髓的基质细胞进行膝软骨的自体移植，取得了一定的修复效果;刘宏伟等［19］报道，利用自体骨髓基质细胞进行牙周移植，可加快牙槽骨的再生。以上结果充分说明骨髓基质细胞不仅可作为骨组织修复再生提供细胞来源，亦可作为牙周再生的种子细胞，而且将其应用于牙周组织工程的许多研究亦均取得成功［20－21］。

1.3 其他来源的干细胞

虽然BMSCs和PDLSCs是目前较为成熟的种子细胞，但由于BMSCs的扩增能力有限，对生长因子的反应常会随供髓者的年龄增长而降低，致其成骨能力下降，加之供者骨髓量有限，一定程度上限制了其作为种子细胞的应用。PDLSCs也因来源有限，不能保证能获得足够的用于牙周组织再生治疗的细胞。脂肪干细胞(adipose tissue－derived stem cells，ADSCs)是近年研究发现的一种新的成体干细胞，该细胞增殖能力强，体外培养能保持稳定的生长增殖活性，且具有多向分化的潜能，有可能成为牙周组织工程新的种子细胞［22］。与 BMSCs和PDLSCs相比，ADSCs还具有以下优点:①取材方便，脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富，可通过常规抽脂手术获得脂肪而不会影响其细胞的活性［23］;②具有良好的体外扩增能力;③具有一定的免疫调节能力。有研究表明，ADSCs与BMSCs具有相似的免疫原性，在体外可抑制淋巴细胞增殖，调节淋巴细胞的反应能力［24］，提示ADSCs有可能成为组织工程或细胞治疗中同种异体细胞来源。而且BMSCs的成骨能力也得到了确认，De Ugarte DA 等［25］在比较人 BMSCs、ADSCs的成骨性的实验中发现:二者的成骨分化能力没有明显区别，说明ADSCs有可能作为牙周组织工程的种子细胞。

此外，Jin等［26］还成功克隆了成牙骨质细胞、牙周膜成纤维细胞和牙滤泡细胞，并通过研究表明:其中成牙骨质细胞是牙周组织工程的又一重要种子细胞来源。牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast cells，GFCs)是牙周组织的组成成分，具有很强的生长和自我繁殖能力，在适当的刺激下，可表达成骨细胞表型，且来源丰富，容易获得，亦有望成为牙周组织工程的理想种子细胞［27－28］。组织工程种子细胞来源还有一种途径是胚胎干细胞，是一种来源胚胎的具有高度增殖和多向分化能力但尚未分化的细胞，在一定条件下具有向3个胚层组织和细胞分化的全能性。美国Gearhart实验室(1998)开始了人胚胎干细胞的建系，Geubinoff等(2000)［29］成功地从人囊胚建立了两株未分化的人胚胎干细胞系。胚胎干细胞领域的迅速发展和所取得的瞩目成就，有可能为牙周组织工程提供足够的种子细胞来源［30］。日本科学家Shinya Yama naka(2006)［31］又提出了一种功能干细胞(induced pluripotent stem，iPS)模型，或称诱导性多潜能干细胞，是将一些多能遗传基因导入皮肤等受体细胞后进一步体外诱导分化而得到的理想细胞。iPS细胞不仅具有和胚胎干细胞类似的功能，还避免了胚胎干细胞所面临的伦理和法律等问题，目前已成为干细胞研究的热点领域之一，并被用于组织工程领域。Duan等［32］将iPS细胞与釉基质衍生物(enamel matrix derivatives，EMD)结合进行了牙周组织再生实验，结果显示结合了EMD的iPS细胞可以增强新骨的再生，而且将结合了EMD的iPS细胞利用组织工程技术移植入牙周缺损处亦可明显增强牙周组织的再生［32］。

2 干细胞用于牙周组织再生治疗的主要方法

2.1 干细胞体内移植

随着对干细胞研究的不断深入，许多研究均表明:通过干细胞体内移植能不同程度的促进牙周组织的再生，而且简便、易行。传统的方法是将细胞悬液直接注射到组织病损区。Mc Guire等［33］为恢复牙乳头的高度，将病人自体牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast cells，GFCs)多次注射到预处理的牙龈乳头处，结果显示:只在组织愈合的前2个月有较明显效果，但不能完全恢复初始高度。因此，一些学者认为，此方法虽然简便，创伤小，但只能促进少量牙龈缺损的修复，尚存在一定的缺陷:①由于液体的流动性，注射后细胞悬液的大小、形状和在组织中的分布难以控制;②细胞注射液不能提供一定的机械支持力;③细胞注射后常呈岛形聚集，与受体组织间的粘附性差，不利于细胞生长和发挥功能;细胞迁移进入毛细血管可能导致毛细血管栓塞，影响局部血供［34］。

2.2 细胞膜片技术

细胞膜片技术是利用温敏型多聚－聚末端异丙基丙烯酰胺(poly N－isopropylacylamide，PIPAAm)在高于或低于临界温度32℃时的亲水性和疏水性变化来实现其对细胞粘附控制的技术。当温度低于32℃，PIPAAm的异丙基支链充分伸展，呈亲水性;相反则呈疏水性。由于细胞膜表面的疏水结构，当温度高于32℃时，细胞在其表面粘附生长;而当温度低于32℃以下时，细胞自动分离，因此只需降低温度无需酶消化就可获得完整的细胞。有研究证明［34］:通过该技术获得的细胞活性强，功能完整，且由于保存了培养过程中已形成的细胞外基质和细胞连接，当细胞生长密集时，可实现大量细胞的膜片状分离，而且无需支架材料即可将细胞移植到包括培养皿、其他细胞膜片和机体组织等各种表面上，并能与之粘附［34］。自 Okano 等［35］发明细胞膜片技术至今，该技术不断发展，目前已成功构建了多种细胞膜片。Hasegawa等［36］将人牙周膜细胞膜片移植到免疫缺陷大鼠的近中根骨开裂模型上，术后4周实验组所有牙本质表面均有一薄层牙骨质样硬组织形成，并有新生的纤维结构斜插入其中，表明细胞膜片技术可用于牙周组织的再生。Akizuki等［37］在犬自体牙周膜细胞培养中添加抗坏血酸(能增加其Ⅰ型胶原的分泌，以提高细胞膜片的强度)制备细胞膜片，以透明质酸膜为载体将其移植于比格犬双侧下颌第一磨牙近中根颊面骨开裂模型的缺损区，术后8周，实验组3/5的标本可见新生成的牙槽骨、牙骨质和牙周韧带，部分标本可见新生血供丰富的胶原纤维垂直插入新生骨和新生牙骨质中，提示牙周膜细胞膜片有促进牙周组织再生的潜能。Iwata等［38］将3层经成骨诱导的牙周膜细胞膜片移植到三壁骨缺损的牙根面上，并用多孔β－磷酸三钙填满剩余缺损区，结果显示:细胞膜片植入区有骨和牙骨质再生，并连接有定向排列的胶原纤维。以上研究结果表明:牙周膜细胞膜片有多向分化的性质，并能促进由软、硬组织构成的牙周组织的再生。但细胞膜片技术仍存在着一定的局限性:①虽然获取细胞膜片无需酶消化，但在早期的细胞培养过程中仍无法避免酶对细胞的损伤;②细胞膜片强度不足、在移植过程中需要辅助介质，如透明质酸膜［37］纤维凝胶［39］等以增加其强度，不能完全脱离生物材料的使用;③温敏型培养皿需特殊构建，成品UpCellTM(CellSeed公司，日本)价格相对昂贵。因此，细胞膜片技术并非理想的牙周再生技术。

2.3 组织工程技术

上世纪80年代中期开始，大量的治疗方法开始用于牙周组织的再生治疗，其关键的问题是如何能使具有再生能力的牙周前体细胞首先占据根面，然后再进行足够的冠向迁移。目前，牙周组织再生的研究主要包括三个方面:①牙龈上皮和结缔组织的生长优势的抑制，即膜引导组织再生术(guided tissue regeneration，GTR);②牙周前体细胞再生潜能的激活，包括细胞移植和细胞因子对前体细胞活性的调控作用;③病变组织的去除，包括外科翻瓣术和根面平整。Murphy等［40］称之为引导法、诱导法及细胞法，并认为这3种方法体现了工程学思想，但均在不同程度上存在着缺陷。近年来，组织工程学的迅速发展为牙周组织再生提供了新的思路，将膜技术细胞移植和细胞因子的调控融为一体，从而实现修复和重建牙周组织缺损的目的。其基本方法是将体外培养的高浓度、功能相关的活细胞种植于具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料上，经过一段时间的培养，再将这种细胞与生物材料复合体植入机体病损部位以形成新的具有原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。一些关于牙周再生的研究表明:从骨髓腔或牙组织中分离出干细胞，经体外扩增后，将细胞种入支架材料或其他基质材料如胶原基质、β－磷酸三钙(beta－tricalcium phosphate，β－TCP)以及结合了 β－TCP的细胞外基质等材料上，再将其植入缺损处，均显示出较好的再生潜能［1，41－42］。组织工程技术在牙周再生领域的应用成为牙周再生发展的里程碑，为牙周再生提供了广阔的应用前景和研发空间。

2.4 基因工程技术

基因治疗分为体内和体外两种途径，前者将基因直接介导至体内特定位点，通过转染邻近多种类型的细胞而发挥作用;后者将基因在体外转染特定细胞后，再将细胞回植入体内。目前运用的主要是体外基因治疗，而在牙周再生治疗中多见基因工程与组织工程的联合应用，即将体外培养并经过特定基因重组修饰的组织细胞附于一定的载体上再植于牙槽骨的缺损处，进而诱导促进骨组织和牙周韧带的重建修复。Jin等［43］报道:将利用基因转染技术获得的稳定表达骨诱导形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)的种子细胞在体外与明胶复合后，用于鼠牙槽骨人工缺损的修复取得成功，为BMP在牙周组织工程中的应用开辟了新空间［44－45］。Giannobile 等［45］发现，血小板源性生长因子(platelet－derived growth factor，PDGF)对牙周组织再生具有明显促进作用，Anusaksathien等［46］利用PDGF－A，PDGF－B基因转染的人 GFCs在体外修复胶原三维晶体，通过图像分析和RT－PCR检测结果提示，PDGF基因转染的人GFCs具备潜在的修复牙周软组织缺损的能力;Gamelo等［28］第一次通过实验证明，利用人PDGF－BB重组体可以获得Ⅱ度根分叉病变牙周组织的完全再生。同时，也有大量研究显示，胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor，IGF)，转化生长因子 β(transforming growth factor－β，TGF－β)等也能明显促进牙周组织的再生和修复。这些研究成果给牙周组织再生工程提供了新的技术途径。

3 干细胞治疗牙周组织再生所面临的挑战

组织工程和基因工程在牙周病治疗领域的发展为牙周组织再生提供了广阔的前景，但基于牙周组织结构的复杂性，要想实现完全的牙周组织再生仍然是一个具有挑战性的课题。虽然牙周膜内富含干细胞，其组织也具有高度的再生潜力，但在利用干细胞进行牙周治疗时依然会面临诸多难题，如传染性、癌变可能、免疫错乱以及胚胎干细胞应用所引起的道德争论等。同时还存在干细胞体外培养需要标准的培养条件和严格的调控措施;其临床转化面临着人力、物力和财力不足的问题;以及在治疗一些非致死性疾病(如牙周疾病)时，对“取”与“舍”仍然存在争议的问题，凡此种种均表明加速干细胞治疗牙周病的临床转化仍任重而道远。

如何利用自身组织的细胞进行牙周组织的再生修复治疗也是我们关注的热点，这也是内源性再生医学领域所研究的内容。如果能够利用细胞归巢的机制解决种子细胞的来源问题，使自身的干细胞归巢到牙周缺损处，将会解决异体或自体细胞来源的诸多问题。与淋巴细胞的归巢相似，间充质干细胞也可以出现细胞归巢，但是很多对间充质干细胞迁移归巢的研究显示，靶向组织中的植入干细胞检出率很低，即便将干细胞注入体内其穿越血管选择性的到达靶器官并定植的比例也很低，一定程度上影响了其对组织的修复作用。另外，还有研究表明，干细胞向损伤或缺血等组织的归巢行为及其所涉及的一系列分子均与白细胞向炎性组织的归巢机制十分相似。虽然干细胞向损伤或缺血组织归巢的具体机制至今仍不明确(白细胞向炎性组织的归巢机制已经比较清楚)，但是，已经证实一些分子参与了MSCs的归巢。如:趋化因子家族及其受体，一直被认为是介导白细胞在正常或炎症条件下的迁移和体内重分配的重要因子;而现在许多研究表明，它们也是操控MSCs动员和迁移的重要因子。Bhakta等［47］研究发现:基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor－1，SDF－1)能促进 MSCs迁移。Wang等［48］通过研究证实，BMSCs的定向迁移对SDF－1的浓度具有依赖性;并认为SDF－1通过与其受体CXCR4结合来趋化MSCs的迁移作用。干细胞归巢是干细胞治疗的前提条件，只有保证一定的归巢率才能保证其疗效。目前，干细胞的归巢率低主要与其机制不明有关，仍需要进一步对基因和信号分子的研究。但是，利用干细胞“归巢”参与组织再生的现象已经引起了学者的高度关注，成为内源性再生技术的核心，并在一些动物模型中得到证实［49］。毛剑(Jeremy J.Mao)及其领导的课题组利用干细胞归巢在动物体内实现了牙周组织和牙髓的再生，为内源性再生技术的利用提供了依据［50－51］。

综上所述，干细胞的研究为牙周组织再生解决了种子细胞的来源问题，有理由相信，随着组织工程和基因工程的不断发展和完善，关于牙周组织再生的课题定将有一个新的突破。

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