金银花中绿原酸的微波辅助提取工艺研究

李燕婷，周文富

(三明学院化学与生物工程系，福建 三明 365004)

金银花，别名忍冬，是忍冬科多年生半常绿缠绕木质藤本植物[1～4]。金银花为干燥花蕾或初开的花，在我国东三省、广东、海南、山东、喜马拉雅山均有广泛分布。金银花甘寒清热而不伤胃，芳香透达可以祛邪，还可散风热，对发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症均有明显疗效[5～10]，是清热解毒的良药。金银花的特征活性成分为绿原酸，其结构式如下[1]：

绿原酸是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水、醇、丙酮等[5～7]，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂、提高白细胞数量、增强免疫调节、增香护色等作用[5～12]，广泛应用于食品保鲜及化妆品行业。绿原酸是很多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要成分。

绿原酸的提取一般采用煎煮法、浸渍法、回流法[3，4，13，14]、沉淀法、萃取法、层析法等。但这些常规的提取分离方法均有不足之处，如煎煮法和浸渍法提取率较低、溶剂用量极大、耗时较长；回流法需要加热，耗时较长；沉淀法分离效果不好；萃取法所需溶剂用量大；层析法成本高、操作复杂[2]。微波辅助提取法是近几年发展起来的提取植物有效成分的一种新技术，微波对细胞具有破壁作用和加热作用，能加速细胞内药物成分的快速溶出，具有穿透力强、节能、省时、提取率高等诸多优点，因此被广泛应用于天然产物的提取。

作者在此采用微波辅助法提取金银花中的绿原酸，并对提取工艺条件进行优化，拟为金银花的综合利用提供新途径。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

金银花，产自福建三明，秋季。

98%绿原酸标准品，上海源叶生物科技有限公司；95%乙醇、固体氢氧化钠，分析纯；37%盐酸溶液、乙酸乙酯溶液，化学纯。

NT207型实验专用微波炉；UV-1100型紫外可见分光光度计，北京瑞利公司；FA1604N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SHB-3型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52B型旋转蒸发仪，上海博经经贸公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海基玮试验仪器设备有限公司；玻璃仪器气流烘干器，巩义市予华仪器责任有限公司；360型FTIR红外光谱仪，英国Nicolet公司；UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津苏州仪器公司。

1.2 方法[8，9]

1.2.1 绿原酸标准曲线的绘制

准确称取绿原酸标准品5.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加适量0.2 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得到0.05 mg·mL-1绿原酸标准溶液。精密吸取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL标准溶液分置于10 mL容量瓶中，加入适量0.2 mol·L-1盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀，静置数分钟，以不加绿原酸的试剂作空白对照。用紫外可见分光光度计在324 nm处测定吸光度[15]，以绿原酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 绿原酸的提取

将洗净、干燥的金银花用搅拌机粉碎，过40目筛，备用。

分别配制50%氢氧化钠溶液、0.2 mol·L-1盐酸溶液、不同体积分数的乙醇溶液。

准确称取金银花1 g，按照下列流程制取样品溶液：金银花→粉碎→浸渍→调节pH值→微波浸提→减压抽滤→循环一次→调节pH值→萃取→调节pH值→定容至100 mL。趁热减压抽滤，将滤液移至梨形分液漏斗中加石油醚纯化脱除杂质，移至100 mL容量瓶定容后摇匀，作为供试液备用。

准确吸取供试液0.5 mL，置10.00 mL容量瓶中，按1.2.1方法测定吸光度。根据回归方程，计算样品中绿原酸浓度，按下式计算绿原酸的提取率：

式中：X为绿原酸提取率，%；c为绿原酸浓度，μg·mL-1；W为样品质量，g。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

准确称取样品5.00 mg，定容至100 mL容量瓶中。摇匀，静置数分钟，以试剂空白溶液作对照品，用紫外可见分光光度计于200～500 nm范围内扫描。结果表明：样品溶液在波长324 nm处有最大吸收峰。因此，选择324 nm作为检测波长。

2.2 绿原酸的标准曲线(图1)

图1 绿原酸的标准曲线

对标准曲线进行线性拟合，得到线性回归方程为：A=0.6208c-0.4924，R2=0.9912。

2.3 绿原酸的结构分析

2.3.1 红外光谱分析

精密称取样品0.1 g，研细后用溴化钾压片，置于红外光谱仪下测试，结果见图2。

图2 绿原酸样品(a)与标准品(b)的红外光谱

由图2可知，绿原酸样品与标准品的红外光谱图基本一致。3373 cm-1处为-OH的吸收峰，3030 cm-1处为苯环C-H的伸缩振动峰，1687 cm-1处为-C=O的伸缩振动峰，1638 cm-1、1602 cm-1处为C=C的伸缩振动峰，1600 cm-1、1580 cm-1、1500 cm-1、1450 cm-1处为苯环骨架C=C的伸缩振动峰，1457 cm-1、1398 cm-1处为-CH3的弯曲振动峰，1288 cm-1处为C-O的伸缩振动峰，1085 cm-1处为C-O-C的伸缩振动峰。

2.3.2 紫外光谱分析

精确称取样品5.00 mg，溶于100 mL容量瓶中，以试剂空白溶液作对照品，置于紫外光谱仪下测试，结果见图3。

图3 绿原酸样品(a)与标准品(b)的紫外光谱

由图3可知，绿原酸标准品在300～350 nm有一个吸收峰，绿原酸样品在300～350 nm也有吸收峰且吸收峰的位置、形状和强度与绿原酸标准品非常相似。这表明实验所得绿原酸的骨架和官能团结构与绿原酸标准品相似。

2.4 单因素实验

2.4.1 乙醇体积分数对绿原酸提取效果的影响

称取金银花1.0000 g，在料液比为1∶10(g∶mL，下同)、微波处理时间为3 min、微波功率为200 W的条件下，考察乙醇体积分数对绿原酸提取效果的影响，结果见图4。

图4 乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响

由图4可知，随着乙醇体积分数的增大，金银花绿原酸提取率先升高后降低，在乙醇体积分数为70%时，提取率最高。这是由于，绿原酸是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，极性与乙醇相对接近，根据相似相溶原则，绿原酸能溶于乙醇溶液；当乙醇体积分数超过70%时，乙醇水溶液的极性相对偏低，则绿原酸的溶解度也降低，且乙醇体积分数过高，还会使金银花中某些脂质性物质溶出增多，竞争同乙醇溶剂的结合，导致绿原酸提取率的降低。因此，选取60%、70%、80%为乙醇体积分数水平进行正交实验。

2.4.2 料液比对绿原酸提取效果的影响

在乙醇体积分数为70%、微波处理时间为3 min、微波功率为200 W的条件下，考察料液比对绿原酸提取效果的影响，结果见图5。

图5 料液比对绿原酸提取率的影响

由图5可知，绿原酸提取率随着料液比的减小(即提取剂用量的增大)呈先降低后升高的趋势，在料液比为1∶10时，提取率最高。这是因为，提取剂用量增大，会增加对微波能的吸收，导致所需物质对微波能吸收相应减少，细胞壁破裂不完全，绿原酸就不能从细胞中充分溶出。因此，选取提取率较高的料液比水平即1∶10、1∶20、1∶30进行正交实验。

2.4.3 微波功率对绿原酸提取效果的影响

在乙醇体积分数为70%、微波处理时间为3 min、料液比为1∶10的条件下，考察微波功率对绿原酸提取效果的影响，结果见图6。

图6 微波功率对绿原酸提取率的影响

由图6可知，随着微波功率的增大，绿原酸提取率呈先降低后升高的趋势，当微波功率大于225 W后绿原酸提取率随微波功率的增大而升高。这可能是因为，增大微波功率，微波加热的速率加快，分子的运动速度相应加快，物质之间的摩擦增加，物质的渗透、扩散和溶解速度加快，有利于绿原酸由金银花的外层细胞转移到乙醇溶剂中，但若微波功率过大，金银花中的鞣质、黄酮和木犀草黄素等粘液杂质也会大量溶出，溶在乙醇中且不能很好地去除。因此，选取250 W、275 W、300 W为微波功率水平进行正交实验。

2.4.4 微波处理时间对绿原酸提取效果的影响

在乙醇体积分数为70%、微波功率为300 W、料液比为1∶10的条件下，考察微波处理时间对绿原酸提取效果的影响，结果见图7。

图7 微波处理时间对绿原酸提取率的影响

由图7可知，随微波处理时间的延长，绿原酸提取率先升高后降低，在微波处理时间为7 min时，绿原酸提取率最高。这可能是由于，微波辐射在短时间内对金银花细胞膜的破碎作用较大，所溶出的物质较多，所以绿原酸提取率起初随着微波处理时间的延长而升高。但是长时间微波辐射产生的强热效应会破坏绿原酸成分，导致提取率下降，且微波处理时间越长，溶剂挥发越多；绿原酸的稳定性也由于长时间浸在溶液中受到影响。因此，选取5 min、7 min、9 min为微波处理时间水平进行正交实验。

2.5 正交实验

选择乙醇体积分数、微波处理时间、料液比、微波功率作为考察因素，每个因素取3个水平，以绿原酸提取率为评价指标，进行L9(34)正交实验，其因素与水平见表1，结果与分析见表2。

表1 正交实验因素与水平

表2 正交实验结果与分析

由表2可知，各因素对金银花绿原酸提取率的影响大小依次为：微波处理时间>乙醇体积分数>微波功率>料液比，其中微波处理时间影响最大，乙醇体积分数、微波功率次之，料液比影响最小。最佳提取工艺为A1B3C1D3，即乙醇体积分数为60%、微波处理时间为9 min、料液比为1∶10、微波功率为300 W。

为了验证优化结果的可靠性，在乙醇体积分数为60%、微波处理时间为9 min、料液比为1∶10、微波功率为300 W的条件下进行验证实验，平行做2组，平均提取率为3.779%。

3 结论

(1)通过单因素实验和正交实验确定微波辅助提取金银花中绿原酸的最佳工艺为：乙醇体积分数60%、微波处理时间9 min、微波功率300 W、料液比1∶10(g∶mL)，此时，提取率为3.779%。

(2)未除净的色素(如叶黄素、叶绿素、胡萝卜素等)基团可与显色剂显色，导致吸光度增大、提取率假性升高，趁热抽滤后的粗产品的纯化去除脂溶性色素也是影响产品得率的关键因素。

(3)微波法与传统提取方法相比，操作时间明显缩短，且无需回收溶剂，具有省时、高效、节能、少污染、低成本的优点。

[1]杨怀霞，寇西桃，武雪芬，等.金银花茎叶中绿原酸的新分离方法研究[J].河南中医药学刊，2000，15(4)：16-17.

[2]张文清，郑琪.金银花中绿原酸提取工艺的研究[J].广西轻工业，2000，8(1)：33-34.

[3]Daszykowski M，Walczak B，Massart D L.Representative subset selection[J].Analytica Chimica Acta，2002，468(1)：91-103.

[4]Wu W，Walczak B，Massart D L，et al.Artificial neural networks in classification of NIR spectral data：Design of the training set[J].Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，1996，33(1)：35-46.

[5]Ronsted N，Strandgaard H，Jensen S R,et al.Chlorogenic acid from three species ofHydrostachys[J].Biochemical Systematics and Ecology，2002，30(11)：1105-1108.

[6]Awad M A，Jager A，Westing L M.Flavonoid and chlorogenic acid levels in apple fruit：Characterisation of variation[J].Scientia Horticulturase，2000，83(3-4)：249-263.

[7]He Caixia，Cui Hua, Zhao Guiwen.The determination of chlorogenic acid in cigarettes by inhibited chemiluminescence analysis[J].Analytica Chimica Acta，1997，351(1-3)：241-246.

[8]刘仙金，周文富.草珊瑚总黄酮的微波提取研究[J].化学与生物工程，2010，27(1)：44-48.

[9]林燕铃，周文富.微波提取苹果渣中总黄酮的工艺研究[J].应用化工，2011，40(2)：311-314.

[10]余其凤，周文富.莲子心总黄酮的微波辅助提取研究[J].化学与生物工程，2011，28(2)：32-37.

[11]阎东海.提取三要素在金银花提取过程中对绿原酸提出率及稳定性的相关性研究[J].中国中药杂志，1994，19(9)：545-546.

[12]高锦明，张鞍灵，赵晓明，等.绿原酸分布、提取与生物活性研究综述[J].西北林学院学报，1999，14(2)：73-78.

[13]蔡霄英，刘永乐.金银花中绿原酸的分离与测定新方法[J].食品科技，2003，(5)：34-36.

[14]景小琦，武雪芬，雷敬卫.金银花枝叶中粗黄酮、无机元素和蛋白质含量测定[J].河南中医，2001，21(4)：66-67.

[15]何德贵，周芳勇，李仕先，等.金银花不同提取工艺及优选条件探讨[J].中国实验方剂学杂志，2001，7(1)：6-7.